Expresión heteróloga y análisis funcional de una asparaginasa proveniente del arqueón Thermoplasma acidophilum

Abstract

"Las asparaginasas (amidohidrolasas EC 3.5.1.1) son enzimas que catalizan la hidrólisis de L-asparagina hacia ácido aspártico y amonio, han adquirido importancia por su efecto antineoplásico en el tratamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), así como en la industria alimentaria ya que reducen la formación de acrilamida en los alimentos. Enzimas con actividad asparaginasa se clasifican en dos grandes grupos: las tipo bacteriano y las tipo planta. Thermoplasma acidophilum es un arqueón extremófilo que cuenta con un marco de lectura abierta (orf por sus siglas en inglés) Ta0338 que codifica una asparaginasa cuyo análisis bioinformático la clasificó dentro de las asparaginasas tipo planta y de la superfamilia de las Ntn-hidrolasas. En este trabajo, el orf Ta0338 se amplificó del genoma de T. acidophilum y se clonó en el vector de expresión pET28a(+). La proteína recombinante se expresó en la cepa de Escherichia coli BL21(DE3)pLysS a 37°C y se purificó por cromatografía de afinidad a níquel con una producción de 9.68 mg/L. Esta proteína mostró un proceso autocatalítico donde el zimógeno de ~32 kDa se autohidroliza generando la subunidad alfa de ~18 kDa y la beta de ~13 kDa. Análisis de electroforesis en condiciones nativas evidenció un complejo heterotetramérico de ~64 kDa, sugiriendo el arreglo típico de las Ntn-hidrolasas (αββα). Datos preliminares revelan la capacidad de la enzima de hidrolizar L-asparagina."

"L-asparaginases (EC 3.5.1.1) are enzymes that catalyze the hydrolysis of Lasparagine to L-aspartate and ammonium; they have a key pharmacological effect as antineoplastic agent on Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and the decrease of acrylamide formation in industrial food processing. Here we present the characterization of the first plant-type asparaginase from the archaeon Thermoplasma acidophilum. The Ta0338 orf from T. acidophilum was amplified and cloned into the pET28a(+) expression vector. The recombinant protein was expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3)pLysS at 37°C and purified by Ni- NTA affinity chromatography with a yield of approximately 9.68 mg/L. This protein shows an autocatalytic process of the zymogen, producing the expected alpha and beta subunits. Native electrophoresis analysis demonstrates a multimeric complex with an approximate molecular weight of 64 kDa, which resembles to the typical heterotetrameric arrangement of Ntn-hydrolases (αββα). Preliminary data show that the recombinant asparaginase is able to hydrolyze L-asn."