Producción de una vacuna comestible en sistemas vegetales contra el virus sincicial respiratorio

Abstract

"Las enfermedades infecciosas, principalmente las respiratorias, son un campo importante en el desarrollo de las vacunas, debido a los altos costos de hospitalizan que se generan de ellas; el virus sincicial respiratorio (VSR) es el principal patógeno de este tipo de enfermedades en niños; asimismo, es uno de los principales patógenos de vías respiratorias en ancianos. Actualmente no existe una vacuna para prevenir su infección. El presente trabajo se enfoca al desarrollo de una vacuna comestible contra VSR en plantas. Se generaron vectores para transformación nuclear de lechuga y tabaco, así como para cloroplastos de tabaco conteniendo epítopos de los genes F y G de VSR. Se transformaron genéticamente plantas de tabaco y lechuga por medio de Agrobacterium tumefaciens portando los genes nativos de las proteínas F y G de VSR y dos genes sintéticos optimizados para plantas: uno codifica para un polipéptido que contiene dos adyuvantes, tres epítopos de la proteína F y un epítopo de la proteína G unidos por péptidos conectores y el otro codifica para un péptido similar al cual se le ha eliminado el epítopo de la proteína G. Además se inició la transformación de cloroplastos de tabaco por el método de biobalística con genes sintéticos. Al igual que los utilizados para la transformación nuclear uno contiene tres epítopos de la proteína F y uno de G mientras que el otro solo contiene los de la proteína F. Para la transformación nuclear de lechuga se logró regenerar callos con las construcciones de los genes sintéticos y del gen nativo G, mientras que en el caso de tabaco, con el gen sintético que contiene los cuatro epítopos, se logró regenerar plantas completas a las que se les verificó la integración del transgén por PCR y se confirmó la antigenicidad por un ensayo inmunoenzimático (ELIZA) con anticuerpos específicos contra la proteína F del VSR y también se obtuvieron callos resistentes al agente de selección de las construcciones con los genes nativos F y G. En la transformación de cloroplastos de tabaco se logró regenerar callos resistentes al medio de selección con las dos construcciones utilizadas (con y sin el epítopo del gen G). El tenes callos resistentes al agente de selección nos permite considerar la posibilidad de obtener plantas transgénicas y/o transplastómicas con las otras construcciones, trabajo a realizarse posteriormente. Este es el primer trabajo donde se han incluido cuatro diferentes epítopos de regiones antigénicas del VSR y se han introducido a plantas, además de demostrar que son funcionales in vitro, lo cual es el primer paso para un trabajo futuro de funcionalidad in vivo. Las diversas construcciones generadas nos permitirán comparar si los niveles de expresión de la proteína con los genes sintéticos son similares o superiores a las construcciones con los genes nativos, además del tipo de respuesta inmune (Th1 o Th2) que se genere en pruebas en ratones. Por otro lado el contar con construcciones con y sin el epítopo G nos ayudará a determinar si la presencia de antígenos de esta proteína altera el balance de la respuesta inmune (Th1/Th2) generado."

"Respiratory tract infections are a leading cause of morbidity and mortality world-wide and an important area for vaccine development based on the high costs associated to their treatment. Respiratory syncytial virus (RSV) is the most important pathogen leading to hospitalizations in young children but is also important in elderly people. Although RSV has been well recognized for more than 40 years, an effective vaccine is not yet available. The current work focused on the expression of antigenic peptides derived from RSV in plants as a first step for the development of an edible vaccine. Vectors for nuclear transformation of lettuce and tobacco were obtained as well as for tobacco chloroplast transformation, harboring antigenic sequences of the F and G genes of RSV. Tobacco and lettuce plants were transformed by co-cultivation with Agrobacterium tumefaciens containing the native genes of the F and G proteins from RSV, and two synthetic genes optimized for their expression in plants. One of these genes encodes for two adyuvants and three epitopes from the F protein and an additional epitope from the G protein fused by linkers. The peptides were selected based on their theoretical antigenicity. The second synthetic gene is similar to the first one, but the G epitope was deleted. Also, tobacco chloroplast transformation was started by biolistic assay with plasmids designed for homologous recombination. A biolistic vector including three epitopes of the F protein and one of the G protein fused by linkers was used; in addition another vector that lacked the G epitope was used. This strategy will allow us to compare the immunological responses of immunized mice with different compositions of recombinant protein. As for the nuclear transformation of lettuce, it was possible to regenerate calli that contain the native G gene, as well as calli that contain the synthetic genes (F-G and F alone). In regards to the nuclear transformation of tobacco, adult plants transformed with the synthetic genes (F and G) were obtained and the presence of this gene was corroborated by a PCR assay. The functionality of the protein produced in plants was demonstrated based on the results of an in vitro immunoassay. The ELISA was carried out with specific monoclonal antibody against the F protein of RSV."