La carga de virus del papiloma humano tipo 16 no correlaciona con las lesiones neoplásicas del cérvix y es consistente con deleciones de los genes virales E2 y E6

Abstract

"CONTEXTO. El cáncer cervicouterino se desarrolla en infecciones persistentes del epitelio del cuello uterino por virus del papiloma humano (VHP) de al to riesgo, entre los cuales predomina el tipo 16 (VHP16) cuyo genoma -DNA circular de cadena doble codifica seis genes de proteínas no estructurales, entre ellos el represor E2 y las oncoproteínas E6 y E7- se replica en el número de las células epiteliales en diferenciación. La integración del genoma viral al genoma celular, aparentemente esencial para iniciar la transformación neoplásica, usualmente se acompaña de escisión/interrupción del gen E2. Las lesiones neoplásicas progresan hasta el cáncer invasor (CC) pasando por infección (IVPH), neoplasia intraepitelial de bajo grado (NIC1) y de alto grado (NIC2 y NIC3). Se supone que en las lesiones de bajo grado predomina el genoma viral en estado plasmídico (con igual número de los genes E2 y E6 y cociente E2/E6 ~1) y en lesiones cancerosas el estado integrado (con pérdida del gen E2 y cociente E2/E6 ~0). La cuantificación del oncogén E6 de VPH16 (E6 - VPH16) mediante PCR en tiempo real (qPCR) con SYBRGreen (fluorocromo intercalante del DNA) ha sido empleada para correlacionar la carga viral y el cociente E2/E6 con el grado de las lesiones neoplásicas. EvaGreen, un nuevo fluorocormo intercalante, ha sido empelado para cuantificar el DNA y propuesto para la qPCR. PROPÓSITO. En este trabajo comparamos la eficiencia de EvaGreen y SYBRGreen para cuantificar E6-VPH16 por qPCR, desarrollamos un método ultrasensible con EvaGreen basado en preamplificación convencional seguida de qPCR anidada para evaluar las cargas de E2 y E6 y el cociente E2/E6. MÉTODOS. Cuantificamos la carga de E2 y E6 en los raspados cervicales de 35 mujeres con lesiones displásicas y cancerosas e infección única por VPH16. RESULTADOS. La cuantificación de E2 y E6 fue reproducible y el promedio de ciclos umbrales (Ct) fue 4.4 ciclos menor con EvaGreen que con SYBRGreen. Los perfiles de extinción térmica de fluorescencia de los productos amplificados de los raspados cerviclaes fueron idénticos a los amplificados a partir del genoma de VPH16 auténtico. Las mezclas de qPCR directa y anidada con diluciones logarítmicas seriadas que contenían 2.5x10^3-2.5x10^6 copias de la construcción pHV101 (con el inserto de E6) dieron valores de Ct en los rangos de 18.7-29.0 y 10.0-25.0, respectivamente."

"CONTEXT. Cancer of the cervix uteri (CC) develops in persistent infections of the cervical epithelium by high-risk human papillomavirus (HPV), among the most prevalent is type 16 (HPV16) whose genome —circular double stranded DNA encoding six nonstructural protein genes that include the E2 repressor and the E6 and E7 oncoproteins— replicates in the nucleus of differentiating cells. Integration of the viral genome to the cell genome, apparently essential to initiate neoplastic transformation, is usually accompanied by escision/disruption of the E2 gene. Progression of neoplastic lesions to invasive cancer (CC) passes through viral infection (HPVI), low grade (CIN1), and high grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2 and CIN3). It is assumed that the plasmid form of the viral genome predominates in low grade lesions (with equal number of E2 and E6 viral genes and E2/E6 ratio 1) and the integrated from in cancerous lesions (with loss of E2 and E2/E6 ratio 0). Quantification of the HPV16 E6 oncogene (E6 -VPH16) by real time PCR (qPCR) with the DNA intercalating fluorochrome SYBRGreen has been used to correlate viral loads and E2/E6 ratios with de grade of neoplastic lesions. EvaGreen, a new intercalating fluorochrome, has been used to quantify DNA and proposed for use in qPCR. AIMS. In this work we compared the efficiency of EvaGreen and SYBRGreen to quantify E6 -HPV16 by qPCR, developed an ultrasensitive method with EvaGreen based on conventional preamplification followed by nested qPCR to assess E2 and E6 loads and E2/E6 ratios.METHODS. E2 and E6 loads were quantified in cervical scrapings from 35 women with cancerous and dysplastic lesions and infected only by HPV16. RESULTS. E2 and E6 quantification was reproducible with the average number of threshold cycles (Ct) being 4.4 cycles lower with EvaGreen that with SYBRGreen. The thermal-extinction-of-fluorescence profiles of products amplified from DNA of cervical scrapes were identical to those amplified from the authentic HPV16 genome. Direct and nested qPCR mixtures prepared with serial logarithmic dilutions containing 2.5×103-2.5×106 copies of the pHV101 construct (with the E6 ORF insert) yielded Ct values in the ranges of 18.7-29.0 and 10.0-25.0, respectively."