Estandarización del método de reducción xantina-XO para determinar el potencial redox estándar de la proteína VVD

Abstract

"Las algas, las plantas, las bacterias y los hongos presentan proteínas que contienen dominios LOV (Light-Oxygen-Voltage) que funcionan como receptores de la luz azul y controlan diversas respuestas celulares. Los dominios LOV se definen como un subgrupo de dominios PAS (Per-ARNT-Sim) que unen un cofactor de flavina capaz de formar un aducto reversible cisteínaflavina en respuesta a su exposición a la luz. A partir de diversos experimentos de caracterización estructural y funcional de los dominios LOV, ya se cuenta con un modelo de la fotoquímica de la formación del aducto. Sin embargo, poco se sabe acerca de si estos dominios son capaces de detectar otros estímulos además de la luz. En este sentido, proponemos como modelo de estudio a la proteína VVD del hongo filamentoso Neurospora crassa, una proteína bien estudiada y caracterizada que cuenta con un único dominio LOV. Como primer paso, se sugiere determinar el potencial redox estándar (E!) del dominio LOV de VVD mediante el sistema de reducción xantina-xantina oxidasa (xantina-XO) previamente reportado en la literatura. Con ello sería posible saber si el valor del potencial redox estándar de la proteína se encuentra dentro de los parámetros fisiológicos del hongo. En el presente trabajo se optimizaron las condiciones de sobreexpresión y purificación de la proteína VVD, evitando su agregación. Encontramos que la concentración de glicerol es un parámetro clave para evitar la formación de agregados. Asimismo, se desarrolló un protocolo experimental para determinar el potencial redox de VVD empleando el sistema xantina-XO. En particular, mediante la variación sistemática de parámetros, logramos obtener las condiciones y concentraciones de los reactantes bajo las cuales se llevarán a cabo las mediciones con la proteína de estudio VVD. Los protocolos desarrollados constituyen la base para determinar el potencial redox no sólo de VVD sino también de otras proteínas de interés que participen en reacciones de óxido-reducción."

"Algae, plants, fungi and bacteria have proteins that contain LOV (Light-Oxygen-Voltage) domains that function as receptors for blue light and control several cellular responses. The LOV domains are defined as a subset of PAS (Per-ARNT-Sim) domains that bind a flavin cofactor capable of forming a reversible cysteine-flavin adduct in response to exposure to light. From various structural experiments and functional characterization of the LOV domains, a model of photochemistry adduct formation has been proposed. However, little is known about whether these domains are able to detect stimuli other than light. Accordingly, we propose as a model of study the protein VVD protein found in the filamentous fungus Neurospora crassa. The protein VVD has a single LOV domain, and has been well studied and characterized. As a first step, it is suggested to determine the standard redox potential (E!) of the LOV domain of VVD by the xanthine-xanthine oxidase (xanthine-XO) reduction system previously reported in the literature. This would make it possible to know if the standard redox potential value of protein is within the physiological parameters of the fungus. In this study, we optimized the overexpression and purification conditions of the VVD protein, preventing its aggregation. We found that glycerol concentration is a key parameter to avoid aggregate formation. In addition, an experimental protocol was developed to determine the redox potential of VVD using the xanthine-XO system. In particular, through systematic variation of parameters, we obtained the reactants conditions and concentrations under which we will carry out the measurements with the our protein of study (VVD). The protocols developed here constitute the basis to determine the redox potential not only of VVD but also from other proteins of interest involved in redox reactions."