Diagnóstico molecular de Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG mediante amplificación por círculo rodante con sondas padlock

Abstract

"CONTEXTO. El diagnóstico de la tuberculosis (TB) zoonótica requiere métodos rápidos, confiables y accesibles que distingan Mycobacterium bovis en la población humana de alto riesgo, pues los métodos microbiológicos tradicionales para diferenciar las especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) son laboriosos y toman varias semanas. Los métodos moleculares para identificar M. bovis se basan en la persistencia de diversas regiones de diferenciación (RD) en los genomas del CMTB. La amplificación por círculo rodante (RCA) basada en sondas padlock circularizables dirigidas a secuencias específicas es un método de amplificación de ácidos nucleicos de nueva generación. El objetivo de este estudio fue desarrollar sondas padlock que distingan segmentos específicos de las regiones de diferenciación RD1, RD4 y RD9 de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG. MÉTODOS. Utilizamos las secuencias del flanco izquierdo y el inicio del extremo 5’ de las regiones RD1, RD4 y RD9 de M. tuberculosis y elementos espaciadores de diferente longitud para construir tres sondas padlock denominadas SP5’RD1, SP5’RD4 y SP5’RD9.Las sondas armadas fueron validadas in silico para descartar la generación de productos de amplificación inespecíficos y la formación de asas de cadena doble en los brazos de captura y extensión que pudiesen interferir con su ligación e hibridación a las secuencias blanco. Posteriormente, ensayamos primero la RCA en mezclas que contenían la sonda SP5’RD4 y una construcción de DNA circular con el insertodeRD4+o el amplicón lineal RD4+. Después determinamos el número mínimo de copias de la secuencia blanco detectables y la cinética de la RCA. RESULTADOS. Los ensayos con SP5’RD4 y el vector de DNA circular con el inserto RD4+ generaron monómeros con la longitud unitaria del vector plasmídico, en tanto que con el amplicón lineal generaron los monómeros esperados; en ensayos ulteriores con todas las sondas SP5’ no empleamos blancos de DNA circular sino lineales (i.e., amplicones o DNA genómico del CMTB). Los ensayos con DNA de las cepas de referencia M. tuberculosis H37Rv y M. bovis AN5 generaron los monómeros esperados para las tres sondas y pudieron detectar desde tres copias de genomas del CMTB en 5 h (90 min para la ligación, 120 min para la RCA, 90 min para la restricción y 120 min para el análisis electroforético)."

"BACKGROUND. Diagnosis of zoonotic TB requires fast, reliable and accessible methods to distinguish Mycobacterium bovis among high-risk human population, because traditional microbiological methods to differentiate species of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) are laborious and take several weeks. Molecular methods to identify M. bovis are based on the persistence of several MTC genomic regions of differentiation (RD). Rolling circle amplification (RCA) based on circularizing padlock probes directed to specific sequences is an isothermal nucleic acid amplification method of new generation. The aim of this study was to develop padlock probes with the ability to distinguish specific segments of the RD1, RD4 and RD9 regions from M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG. METHODS. The left flank and the beginning of the 5'ends of RD1, RD4 and RD9 sequences from M. tuberculosis and three spacer elements of different length were used to design three padlock probes designated SP5’RD1, SP5’RD4 and SP5’RD9. Armed probes were validated in silico to discard the generation of nonspecific amplification products and double stranded loop formation in the capture and extension arms that could interfere with their ligation and hybridization to target sequences. RCA assays were first performed in mixtures containing SP5’RD4 and either a circular DNA vector with the RD4+ insert or the lineal RD4+amplicon. The lowest number of detectable target copies and kinetics were determined later. RESULTS. Essays with SP5’RD4 and the circular DNA vector containing the RD4+ insert generated unit length monomers of the plasmid vector, whereas those with the linear amplicon generated the expected monomers; in further essays with all SP5’ probes no circular but linear DNA targets (i.e., amplicons or MTC genomic DNA)were used. Essays with genomic DNA from the M. tuberculosis H37Rv and M. bovis AN5 reference strains generated the expected monomers and could detect down to three MTC genome copies in 5 h (90 min for ligation, RCA for 120 min, 90 min for restriction and 120 min for electrophoretic analysis).CONCLUSIONS. This work is the first to successfully use padlock probes to differentiate MTC species through analysis of the RD1, RD4 and RD9 regions. Additional padlock probes may be also applied to diagnose other infections and genetically determined diseases and conditions."