Expresión de una proteína de fusión vasostatina 30 y vasoinhibina 14.1 (Osiris) en Pichia pastoris y evaluación de la actividad biológica de la Vasostatina 30 en pez cebra.

Abstract

"El proceso angiogénico consiste en la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y son clave en el crecimiento y metástasis del cáncer; estos proveen oxígeno y nutrientes que permiten el crecimiento del tumor y le proporciona una ruta de escape y diseminación. Los péptidos anti-angiogénicos vasostatina 30 (Vs30) y vasoinhibina 14.1 kDa (Vi-II-14.1) han demostrado una potente actividad anti-proliferativa en células endoteliales, de forma independiente. Por lo que el diseño y desarrollo de una proteína de fusión que incremente la actividad biológica de dichos péptidos es de interés terapéutico. En este trabajo, se llevó a cabo la expresión constitutiva e inducida de una proteína de fusión conformada por los péptidos Vs30 y Vi-II-14.1 en Pichia pastoris, para ello se realizaron ensayos de expresión constitutiva e inducible a nivel matraz. La actividad biológica de la vasostatina 30 sintética (sVS30) y Vs30 producida en P. pastoris se evaluó in vivo en pez cebra e in vitro en cultivos de líneas celulares de cáncer de mama T47D, MDA-MB-468 y MDA-MB-231. La actividad anti-metastásica fue evaluada en embriones de pez cebra transgénicos de la cepa Tg (fli1: EGFP) y1 utilizando dichas líneas celulares de cáncer de mama previamente marcadas con DiL (C59H89ClN2O4). La diseminación de las células cancerosas fue evaluada mediante microscopía de fluorescencia y la actividad anti-angiogénica mediante microscopía confocal. Los resultados obtenidos mostraron la expresión constitutiva e inducida de la proteína de fusión a las 24 y 48 horas de cultivo y su posterior confirmación mediante Western blot. Los ensayos in vivo e in vitro mostraron que la sVs30 no afectó la proliferación de las líneas celulares, pero disminuyó significativamente la diseminación de las células T47D y MDA-MB-468 a una concentración de 1 y 10 µg/mL, así como la formación de vasos sanguíneos intratumorales in vivo a 10 µg/mL. Mientras tanto la Vs30 no mostró un efecto significativo en la diseminación de ninguna de las líneas celulares, sin embargo, mostró un efecto inhibitorio en la formación de vasos sanguíneos intratumorales a una concentración de 1 µg/mL in vivo. Mientras las células MDA-MB-231 no fueron afectadas en su diseminación por Vs30 y sVs30. En comparación, la angiostatina y la angiogenina disminuyeron significativamente la diseminación de las células T47D y MDA-MB-468 y no mostraron un efecto inhibitorio en la formación de vasos sanguíneos intratumorales a una concentración de 1 µg/mL in vivo."

"The angiogenic process consists in the formation of new blood vessels from the preexisting ones and has a key role in cancer growth and metastasis. The new blood vessels provide oxygen and nutrients that allow tumor growth and a dissemination route for cancer cells. The anti-angiogenic peptides vasostatin 30 (Vs30) and vasoinhibin 14.1 kDa (Vi-II-14.1) have shown a potent anti-proliferative activity in endothelial cells and the design and development of a fusion protein with increased biological activity is therapeutically interesting. In this work, the expression of a fusion protein made by the peptides Vs30 and Vi-II-14.1 was performed in Pichia pastoris. To achieve this, constitutive and inducible expression assays were performed in flask. On the other hand, the biological activity of synthetic vasostatin (sVs30) and Vs30 produced in Pichia pastoris was evaluated in vivo in zebrafish and in vitro in cultures of breast cancer cell lines. The antimetastatic activity was analyzed in transgenic zebrafish embryos Tg (fli1: EGFP) y1 using breast cancer cell lines (T47D, MDA-MB-468, and MDA-MB-231) previously labeled with DiL (C59H89ClN2O4). Breast cancer cell dissemination was evaluated by fluorescence microscopy and the anti-angiogenic activity by confocal microscopy. The obtained results showed a constitutive and inducible production of the fusion protein at 24 and 48 hours of culture and its subsequent confirmation by Western blot. The in vivo and in vitro assays showed that the sVs30 did not affect proliferation of breast cancer cells, however, it decreased significantly T47D and MDA-MB-468 cell dissemination at 1 and 10 µg/mL and inhibited the formation of intratumoral blood vessels in vivo at 10 µg/mL. Meanwhile, Vs30 did not show a significant effect on the dissemination of any of the cell lines, however, it showed an inhibitory effect on the formation of intratumoral blood vessels at 1 µg/mL in vivo. MDA-MB-231 cell dissemination was not affected by Vs30 or sVs30. In comparison, angiostatin and angiogenin decreased the spread of T47D and MDAMB-468 cells and did not show an inhibitory effect on the formation of intratumoral blood vessels at 1 µg/mL in vivo."