Caracterización molecular e inmunológica de transformantes de Chlamydomonas reinhardtii que contienen un péptido antiviral y una proteína antigénica contra el virus de la influenza A H1N1

Abstract

"La infección por el virus de la influenza es la mayor causa de las enfermedades respiratorias a nivel mundial. Actualmente la vacunación y el uso de antivirales son las principales estrategias para combatir este virus. La alta variación génica de este virus implica actualizar las vacunas cada año y requerir plataformas de producción de proteínas recombinantes más rápidas y económicas; dentro de ellas destaca el uso de la microalga Chlamydomonas reinhardtii. En el presente trabajo se plantean dos estrategias para el control del virus de la influenza; la expresión de un péptido antiviral y la producción de una vacuna. El péptido antiviral bloqueador de entrada (EB), se expresó en C. reinhardtii y se determinó su actividad biológica. EB expresado en algas fue capaz de evitar la unión de la hemaglutinina viral con su receptor celular e inhibir la replicación viral de influenza pdm A/H1N1. El EB expresado en algas fue 32 veces más efectivo para evitar la entrada viral en comparación con el péptido EB sintético. Para la segunda estrategia, se generó la proteína antigénica (P.A) con epítopos relevantes del virus de la Influenza A H1N1. El gen codificante para la proteína P.A se integró al núcleo y al cloroplasto de la microalga. La proteína P.A en los extractos de las microalgas transformadas se detectó por Western Blot. Adicionalmente se expresó y se purificó a la proteína P.A recombinante producida en de Escherichia coli BL21, con ella se llevó acabo un ensayo de inmunización en ratones BALB/c. El suero de los ratones inmunizados con P.A recombinante mostraron un título alto de las inmunoglobulinas IgG total, IgG1, IgG2a e IgA y bajo para IgE. Además, mostraron un título neutralizante de 1:4,000 en ensayos de microneutralizacion viral con la cepa de influenza pdm A/H1N1. En conclusión C. reinhardtii es una buena plataforma para la producción de proteínas terapéuticas y la proteína P.A es un prototipo vacunal prometedor al ser inmunogénica e inmunoprotectora."

"Influenza virus infection is the principal cause of respiratory illness worldwide. Currently vaccination and antivirals are the main strategies to fight this virus. The high viral mutation rates involve updating vaccines every year and require more efficient and economical recombinant protein production platforms, an alternative is the use of Chlamydomonas reinhardtii. In this work, two strategies for the control of the influenza virus were proposed; the expression of an antiviral peptide and a vaccine development. The entry-blocker (EB) peptide was expressed in C. reinhardtii and its biological activity was determined. EB expressed in microalgae was able to prevent viral hemagglutinin binding with its cellular receptor and to inhibit influenza pdm A/H1N1 viral replication. EB expressed in algae was 32-fold more effective in preventing viral entry compared to synthetic EB. The second strategy was the production of an antigenic protein (P.A), which contains conserved antigenic epitopes from influenza virus A H1N1. The P.A gene was inserted into the nuclear and chloroplast microalgae genomes. The P.A from transformed microalgae extracts was visualized by Western Blot. Additionally, P.A was expressed and purified from Escherichia coli BL21, then an immunization trial was carried out in BALB/c mice. Serum from mice immunized with recombinant P.A. showed a high titer of total IgG, IgG1, IgG2a and IgA and low for IgE immunoglobulins. They also showed a 1:4,000 neutralizing titers in viral microneutralization trials versus influenza pdm A/H1N1. In conclusion C. reinhardtii is a good platform for the production of therapeutic proteins and P.A protein is a promising vaccine prototype, because it is immunogenic and immunoprotective."