Detección e identificación de los tipos 16 y 18 del virus del papiloma humano por desnaturalización térmica de los amplicones E6

Abstract

"En este trabajo exploramos la posibilidad de identificar los genotipos 16 y 18 del virus del papiloma humano (VPH) por los perfiles de desnaturalización térmica de los amplicones del oncogén E6 generados por PCR en tiempo real (qPCR) anidada en presencia de EvaGreen, mediante preamplificación con los iniciadores consenso GP E6/E7 de Sotlar et al. (2004), seguida de amplificación con parejas de iniciadores tipo-específicos de Sotlar et al. ‘S’, o de Dictor y Warenholt (2011) ‘D’. Mediante PCR de punto final establecimos las condiciones para generar los amplicones E6 con iniciadores S tipo-específicos a partir de los plásmidos pHPV16 y pHPV18. Los valores de Tm en los perfiles de desnaturalización térmica de los amplicones de VPH 16 y 18 generados por qPCR directa con los iniciadores D fueron 84.2 °C y 84.3 °C y con los iniciadores S fueron 83.5 °C y 81.5 °C, respectivamente. En mezclas de qPCR directa y anidada con DNA del raspado cervical APCG (VPH 18 positivo) se mantuvo el valor de Tm del amplicón y en la qPCR anidada el rendimiento fue mayor, pero máximo con los iniciadores S. El perfil de desnaturalización térmica de los productos de qPCR directa en la mezcla con pHPV16 y pHPV18 dio un pico único, intermedio entre los de VPH 16 y 18. Concluimos que los iniciadores S y D para VPH 16 y 18 individuales o mezclados generan los amplicones E6 esperados, pero los dos genotipos pueden distinguirse por su perfil de desnaturalización térmica solamente en mezclas con iniciadores VPH 16-D/18-S o VPH 16-S/18-S. La preamplificación de raspados cervicales con iniciadores GP E6/E7 podría usarse como prueba preliminar de infección, porque daría una señal de fluorescencia mayor que el control sin DNA."

"In this work we explored the possibility of identifying human papillomavirus (HPV) genotypes 16 and 18 through the thermal denaturation profiles of their E6 oncogene amplicons generated by nested real-time PCR (qPCR) in the presence of EvaGreen. Preamplification was performed with the GP E6/E7 consensus primers of Sotlar et al. (2004), followed by amplification with the type-specific primer pairs ‘S’ from Sotlar et al., or ‘D’ from Dictor and Warenholt (2011). Using endpoint PCR, we established the conditions to generate E6 amplicons with S-type-specific primers from plasmids pHPV16 and pHPV18; Tm values in the thermal denaturation profiles of the HPV 16 and 18 amplicons generated by direct qPCR with D primers were 84.2 ° C and 84.3 °C and with S primers 83.5 °C and 81.5 °C, respectively. In direct and nested qPCR mixtures with DNA from the APCG cervical scraping (HPV 18 positive), the Tm value of the amplicon was the same, but the yield was higher in nested qPCR and highest with S primers. The thermal denaturation profile of the direct qPCR products in the mixture with pHPV16 and pHPV18 gave a single peak, intermediate between those of HPV 16 and 18. We conclude that individual or mixed S and D primers for HPV 16 and 18 generate the expected E6 amplicons. However, the two genotypes can be distinguished by their thermal denaturation profile only in mixtures with HPV 16-D/18-S or HPV 16-S/18-S primers. Pre-amplification of cervical scrapings with GP E6/E7 primers could be used as a preliminary test for infection because it would give a higher fluorescence signal than the control without DNA."