Diseño de herramientas moleculares para la caracterización de las proteínas Sir3 y Sir4 en Candida glabrata.

Abstract

"En los últimos años, Candida glabrata ha surgido como patógeno oportunista, especialmente en individuos inmunocomprometidos. Una característica que presenta esta levadura es que se adhiere a células epiteliales. Esta adherencia está mediada por proteínas de pared celular codificadas por una familia de más de 20 genes parálogos (genes EPA). La mayoría de estos genes se encuentran localizados en regiones subteloméricas, donde están sujetos al silenciamiento transcripcional dependiente de la cromatina. Este silenciamiento lo lleva acabo el complejo Sir (Sir2, Sir3 y Sir4), Rap1, Ku70, Ku80 y Rif1. Mutaciones en cualquiera de los genes que codifican para la maquinaria del silenciamiento subtelomérico, vuelve a las células hiperadherentes y resistentes a estrés oxidativo. Esto sugiere que la adherencia y la resistencia a estrés oxidativo, estarían coregulados en este hongo patógeno por un mismo sistema de regulación global, como lo es el del silenciamiento subtelomérico. Adicionalmente ello sugiere que este sistema de regulación global pudiera detectar señales del medio ambiente y responder a éstas, reprogramando la expresión de genes subteloméricos específicos. Hay evidencia que muestra que la maquinaria del silenciamiento subtelomérico puede estar detectando señales extracelulares. En C. glabrata, la proteína Sir2 (una desacetilasa de histonas dependiente de NAD+) detecta los niveles de ácido nicotínico (el acido nicotínico es precursor de NAD+) extracelular. Al disminuir los niveles de ácido nicotínico, disminuyen también los niveles de NAD+ y Sir2 pierde su actividad, esto permite la relajación de la cromatina y la transcripción de algunos genes EPA subteloméricos. En S. cerevisiae, Sir3 se fosforila en respuesta a estrés nutricional y osmótico. No obstante, si el complejo Sir pierde su actividad, ocurre de manera consecuente una desrepresión específica de los genes silenciados. Con base en estos antecedentes nos propusimos determinar si Sir3 y Sir4, pudieran también ser blancos de señales ambientales. Para caracterizar a éstas proteínas diseñamos una serie de herramientas moleculares, que nos permitirán etiquetar a las proteínas Sir3 y Sir4 con diferentes epítopes, y determinar si estas proteínas Sir son blancos de señales extracelulares."

"In recent years, Candida glabrata has emerged as an opportunistic fungal pathogen, especially in individuals with weakened immune systems. C. glabrata is able to adhere to cultured epithelial cells and this adherence is mediated by the Epa cell wall proteins. These cell wall proteins are encoded by a family of around 20 paralogue genes, which are localized mainly in subtelomeric regions. Subtelomeric regions are subject to chromatin-based transcriptional silencing. The proteins involved in subtelomeric silencing are the Sir complex (Sir2, Sir3 and Sir4), Rap1, Ku70, Ku80 and Rif1. Mutations in any of the genes that encode for subtelomeric silencing machinery, render the yeast hyperadherente and resistant to oxidative stress. Adherence and resistance to oxidative stress might be coregulated in this fungal pathogen by a single global regulatory system, subtelomeric silencing. Subtelomeric silencing might be able to sense and respond to environmental signals, thus reprogramming the expression of specific subtelomeric genes. There is evidence that demostrates that the silencing machinery could bethe target of extracelullar signals. In C. glabrata, Sir2 (a NAD+ dependent histone deacetylase) detects the levels of nicotinic acid (NA, NAD+ precursor) as an extracellular signal. Reduced levels of NA, causes reduced levels of NAD+, thus Sir2 loses its activity, allowing the relaxation of the chromatin, and transcription of subtelomeric genes like the EPA genes, which then become hyperadherent. In S. cerevisiae, Sir3 is phosphorylated in response to nutritional and osmotic stress, which causes loss of activity of the Sir complex, and consequently a specific derepression of silenced genes. Based on these findings, we sought to determine whether Sir3p and Sir4, might also be targets of environmental cues. To further understand the role of Sir3 and Sir4, we designed a series of vectors to epitope-tagged these proteins. We envisage that such specific antibodies, would allow us to determine if Sir3 and/or Sir4 are in fact detecting environmental signals."