Clonación del Genoma de la variante potosina del virus del papiloma humano tipo 16.

Abstract

"En México se registran anualmente alrededor de 12,516 casos nuevos y 5,777 defunciones por cáncer cervicouterino. San Luís Potosí es uno de los estados más afectados con una tasa de mortalidad superior a la media nacional. Nuestro grupo demostró que las lesiones preneoplásicas severas y el cáncer cervicouterino invasor predominan entre las mujeres más jóvenes de la ciudad de San Luis Potosí, que en esta ciudad el subtipo Europeo (E) de VPH16 es el de mayor prevalencia y en él predomina la variante A334G (“potosina”), que parece ser más oncogénica que la variante prototípica del subtipo E. El propósito de este trabajo fue desarrollar un protocolo eficiente para clonar el genoma completo de VPH16 que permita secuenciar y registrar la variante potosina de VPH16 y seguir clonando y registrando nuevos subtipos y variantes de VPH que circulan en esta región. MÉTODOS. Diseñamos la pareja de oligonucleótidos convergentes Glob8k-F/Glob8k-R para generar un amplicón de 8,079 pares de bases (pb), que abarca los nucleótidos 5, 203, 323 a 5, 211, 7401 de la familia génica de la β-globina humana; efectuamos la amplificación por L-PCR empleando las condiciones de Stewart et al., con polimerasa rTth, que produce extremos romos. Utilizamos las parejas de oligonucleótidos PEG07/12 de Stewart et al., y VPH16-F/R diseñada por nosotros y las condiciones empleadas para el amplicón β-globina-8 kb para generar el amplicón VPH16-8 kb con el genoma viral completo. Digerimos con Bam HI una mezcla de L-PCR con el amplicón de 8 kb obtenido con la pareja VPH16-F/R. Purificamos el amplicón VPH16-8 kb electroforéticamente y adicionamos un tallo-A a sus extremos con Taq DNA polimerasa en presencia de dATP. Ligamos el amplicón modificado al vector de clonación TOPO-XL y con la mezcla de ligación electroporamos células de Escherichia coli TOP 10 F’. Analizamos electroforéticamente el DNA plasmídico de 14 transformantes resistentes a kanamicina e identificamos el tipo de VPH del inserto de pCML1620 mediante PCR multiplex anidada (PCR-MA) del oncogén E6 empleando como controles positivos DNA de la línea celular SiHa, transformada por VPH16, y de la línea celular HeLa transformada por VPH18. RESULTADOS. Aseguramos la calidad del DNA de los raspados cervicales VPH-16 positivos mediante su capacidad para generar el amplicón β-globina 8 kb por L-PCR con la pareja de oligonucleótidos Glob8k-F /R. Con la pareja VPH16-F/R obtuvimos la banda única de 8 kb esperada para el genoma viral completo amplificado a partir de raspados VPH16 positivos de calidad asegurada. Al incubar el amplicón VPH16-8 kb con Bam HI obtuvimos las dos bandas (de 6,150 y 1,754 pb) esperadas para el genoma completo de VPH16. Con las mezclas de ligación del amplicón VPH16-8 kb unido al vector TOPO XL obtuvimos transformantes de E. coli TOP 10 F por electroporación. Trece de 14 clonas transformantes de E. coli TOP10 portaron una banda plasmídica única enmascarada por comigrar con el DNA cromosómico. El inserto de la construcción pCML1620 contiene el genoma de VPH16 dado que el amplicón generado por PCR-MA para la tipificación fue del mismo tamaño que el de la línea SiHa. CONCLUSIONES. La generación del amplicón β-globina-8 kb con el protocolo de L-PCR empleando polimerasa rTth y los oligonucleótidos Glob8k-F/R asegura la calidad de las muestras cervicales VPH16 positivas para amplificar el genoma viral completo. La pareja de oligonucleótidos PEG07/12 es ineficaz, pero la pareja VPH16-F/R diseñada por nosotros sí genera el amplicón de 8 kb con el patrón de restricción esperado para el genoma completo de VPH16. El amplicón VPH16-8 kb purificado electroforéticamente y adicionado con el tallo-A en sus extremos es ligado eficientemente in vitro al vector TOPO-XL. La mayoría de las clonas de E. coli TOP10 transformadas con las construcciones que portan el amplicón VPH16-8 kb contienen plásmidos que comigran con el DNA cromosómico. El genoma viral completo que constituye el inserto de la construcción pCML1620 corresponde al tipo 16 de VPH. La secuenciación de pCML1620 podría verificar si el inserto corresponde a la variante potosina de VPH16. Este trabajo sienta las bases para seguir clonando nuevos subtipos y variantes de VPH circulantes en esta región."

"In Mexico each year are recorded about 12,516 new cases and 5,777 deaths due to cervical cancer. San Luis Potosi is one of the states most affected, with a mortality rate higher than the national average. Our group demonstrated that severe preneoplastic lesions and invasive cervical cancer are more prevalent in the youngest women of San Luis Potosí city and that the HPV16 European (E) subtype has the highest prevalence and the A334G (“Potosina”) variant, which appears to be more oncogenic that the prototypic E subtype variant, predominates in its oncogene E6 sequences. The purpose of this work was to develop an efficient protocol for cloning the complete HPV16 genome from cervical scrapings that would allow to clone and register the recently discovered HPV16 Potosina variant and to keep cloning and registering new HPV subtypes and variants circulating in this region. METHODS. The Glob8k-F/Glob8k-R convergent primer pair was designed to generate a 8,079-base-pair (bp) amplicon, spanning nucleotides 5, 203, 323 to 5, 211, 7401 of the beta globin gen cluster generated under the L-PCR conditions described by Stewart et al., with rTth polymerase, which produces blunt ends. To generate the HPV16 8 kb amplicon the HPV16-F/R primer pair and amplification conditions for the β-globin-8 kb amplicon were used. Bam HI digestion was performed on a L-PCR mixture containing the 8 kb amplicon generated with the HPV16-F/R pair. A-tailing was added to the ends of electrophoretically purified HPV16-8 kb amplicon with Taq DNA polymerase in the presence of dATP. The modified amplicon was then ligated in vitro to the TOPO-XL cloning vector and used to transform Escherichia coli TOP 10 F’ cells by electroporation. DNA from 14 kanamycin-resistant clones was analyzed by electrophoresis and the HPV type of the pCML1620 insert was identified by nested multiplex PCR (NM-PCR) of the E6 oncogene. RESULTS. The quality of HPV16 positive cervical scrapings was assured for their ability to generate the β-globin-8 kb amplicon with the Glob8k-F/R primer pair. With the HPV16-F/R pair the 8 kb band expected for the complete viral genome amplified from HPV16 positive scrapings with assured quality was obtained. Digestion of the HPV16-8 kb amplicon with Bam HI generated the two bands (6,150 and 1,754 bp) expected for the complete HPV16 genome. E. coli TOP10 transformants were obtained by electroporation with the HPV16-8 kb plus TOPO XL ligation mixtures."