Métodos moleculares que potencian el descubrimiento de nuevas especies de Begomovirus y la detección de infecciones mixtas.

Abstract

"Los geminivirus son fitopatógenos que infectan a una amplia variedad de plantas silvestres y cultivadas, y provocan anualmente grandes pérdidas económicas en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. La familia de los geminivirus se divide en cuatro géneros, el más diverso de los cuales es el de los begomovirus que, por otra parte, es el único que se encuentra representado en nuestro país y el resto de Latinoamérica. Estos virus son transmitidos por un insecto considerado una plaga mundial, la mosquita blanca (Bemisia tabaci Genn), y poseen un genoma que está constituido por una o, más comúnmente, dos moléculas diferentes de DNA circular de cadena sencilla. Entre los begomovirus del continente americano se distinguen dos subgrupos, uno relativamente pequeño pero económicamente importante, denominado “linaje del SLCV”, y el más extenso y diversificado linaje de los begomovirus “típicos”. Los miembros del primer subgrupo se hayan distribuidos en Norteamérica y Mesoamérica, y se distinguen por las características atípicas del dominio 1-140 de la proteína iniciadora de la replicación (Rep) y por el número y arreglo de sus iterones.Las técnicas de diagnóstico molecular actualmente utilizadas no permiten distinguir entre virus de los dos linajes mencionados, por lo que es usual que los virus del subgrupo del SLCV no sean detectados cuando coexisten con otros begomovirus en infecciones mixtas. El genoma B de los begomovirus codifica proteínas involucradas en el movimiento del virus a través de la planta. A pesar de su importancia para la infección, sólo se ha publicado a la fecha la secuencia de un par de iniciadores universales capaces de amplificar una secuencia parcial del genoma B, lo que ha resultado en la acumulación más lenta de datos de secuencia de esos componentes genómicos, en comparación con el acelerado crecimiento de las bases de datos para los genomas A de begomovirus. La incidencia de enfermedades agrícolas causadas por begomovirus ha aumentado explosivamente en las últimas dos décadas, debido en gran medida al incremento en las poblaciones del insecto vector, a la introducción de nuevos biotipos de mosquita blanca a nuestro continente, y a la presencia de cultivos susceptibles durante todo el año. La proliferación de enfermedades asociadas a geminivirus demanda, naturalmente, el desarrollo de métodos de diagnóstico molecular más rápidos y precisos, y de costo más bajo, que los utilizados de manera rutinaria en la actualidad. En el presente trabajo hemos desarrollado dos nuevas metodologías moleculares: la primera facilita el aislamiento y caracterización genómica de virus pertenecientes al linaje del SLCV, para lo cual se diseñaron y probaron experimentalmente 4 nuevos iniciadores “universales. Los productos de PCR generados a partir de estos oligonucleótidos cubren la totalidad del genoma A de los virus del linaje mencionado, y se sobrelapan parcialmente, lo que garantiza la apropiada reconstrucción de las secuencias genómicas a partir de los fragmentos virales amplificados. El desarrollo de la segunda metodología involucró el diseño de 6 iniciadores presumiblemente “universales”, que permiten amplificar en su totalidad el genoma B de begomovirus representativos de América, Asia y África, obteniéndose fragmentos de PCR parcialmente translapados."