Aislamiento e identificación de genes de Sclerotium cepivorum Berk que se reprimen durante la interacción con ajo (Allium sativum L.)

Abstract

"La pudrición blanca es una enfermedad causada por el hongo fitopatógeno Sclerotium cepivorum Berk, es considerada como el principal factor de pérdida en el cultivo del ajo (Allium sativum L.) alrededor del mundo. El control de este hongo representa un gran reto, debido a la capacidad que tiene para formar esclerocios, los cuales, son estructuras de resistencia de gran tolerancia a cambios en los factores ambientales y gran longevidad, ya que pueden permanecer en dormancia durante más de 20 años alojados en el suelo. Varias estrategias han sido empleadas como parte de un programa de control integrado, desafortunadamente, ninguna ha resultado satisfactoria. La identificación de blancos genéticos potenciales que permitan el diseño de estrategias de control de la patogénesis es uno de los enfoques sugeridos y para ello, el estudio de la expresión genética diferencial es una herramienta fundamental. La Hibridación Substractiva bajo condiciones de Supresión (SSH) es una técnica de PCR que permite la identificación de genes inducidos y reprimidos. Recientemente, se han descrito genes que se reprimen en Fusarium oxysporum durante la patogénesis en algodón, los cuales podrían estar involucrados en el fenómeno de atogénesis. De acuerdo a estos antecedentes, nuestro grupo de trabajo tiene el interés en aislar e identificar genes de S. cepivorum que se reprimen durante la interacción con la raíz de ajo como parte de un proyecto global que incluye el análisis de la expresión genética diferencial en el patógeno, en el huésped susceptible y tolerante a la pudrición blanca. Para obtener la SSH, se colocó un diente de ajo y 1 disco de micelio (condición control) y 1 disco de micelio (condición problema), el micelio fue cosechado a las 72 h post-inoculación. Posterior al procedimiento SSH, mediante ensayos tipo Southern a macroarreglos, se seleccionaron un total de 13 unigenes. Los genes identificados en este estudio por comparación con la base de datos NCBI, incluyen los que codifican para la enzima glioxal oxidasa Glo 1, la chaperona MOD E, la proteína Cbk1p, el transportador alta afinidad Nramp 1, la proteína o-fucosiltransferasa, la proteína músculo especifica Murf 1, la proteína nebulina, la proteína de lisis mut E, una transposasa IS10 y proteínas hipotéticas. Algunos de estos genes están implicados en el crecimiento apical, lo cual permite especular que la represión de estos transcritos permite el cambio morfológico que sufre S. cepivorum cuando se encuentra atacando al ajo. Durante la interacción, el micelio del hongo se presenta menos ramificado y alargado comparado con el crecimiento en ausencia de ajo. Para analizar esta diferencia de forma de crecimiento y la expresión de los transcritos de los genes obtenidos, se realizaron experimentos de interacción con disulfuros de dialilo (metabolitos producidos por ajo), con una planta no hospedante (maíz) e interacciones combinando estos componentes. Los resultados confirmaron la represión de los transcritos por el ajo y su metabolito y que el cambio en el patrón de crecimiento del hongo se debe a la presencia de los disulfuros de dialilo y al ajo."

"White rot (WR) caused by Sclerotium cepivorum Berk, is the predominant disease of garlic (A. sativum) crops worldwide. Several strategies for WR control are now being used as part of an integrated control program, but with unsatisfactory results.Therefore, the study of the gene differential expression could provide clues about pathogenesis regulation and may lead to the discovery of molecular targets for novel antifungal drugs. Suppression Subtractive Hybridization (SSH) is a PCR technique which permits the identification of both expressed and repressed genes.Recently, repressed genes have been reported during Fusarium oxysporum-cotton pathogenesis, these genes could be involved in this phenomenon. According to this, we have the interest in isolating and identifying repressed genes of S. cepivorum during fungus-garlic interaction, like part of a global project that includes the analysis of differential genetic expression in the pathogen and in the susceptible ant tolerant host to white rot. Reverse SSH was performed to obtain this objective, where 13 uni-genes were obtained from the reverse subtraction of cDNA pools derived from fungus in absence (tester) and presence (driver). Differential gene expression was confirmed by Southern blot to arrays where replicates of reverse SSH library were individually hybridized with either driver or tester cDNA probes. 13 non redundant genes from 79 clones differentially expressed were isolated and their nucleotide sequences were obtained. Several gene fragments include homologues to glyox1 (glioxal oxidase), Cbk1p protein (required for efficient apical growth), mod-E (chaperone HSP90), nebuline, muscle specific Murf 1, mutE (lysis protein), IS10 transposase, into others. Some of these genes are involved in apical development, so we speculate that this transcriptional repression could be related to a morphological change observed in S. cepivorum when it is interacting with the garlic. At this stage, the mycelium is shorter than in absence of the garlic. In order to analyze this growth pattern and the expression of the isolated genes, several interaction experiments using diallyl disulfide exudates (natural Allium products), non host plant (maize) and a combination of these components were performed. Results confirm that the repression of the isolated genes in presence of garlic and diallyl disulfide exudates correlates with fungal morphological change."