Una nueva variante del papilomavirus humano tipo 16, circulante en San Luis Potosi.

Abstract

"Identificar y determinar la frecuencia de subtipos y variantes del papilomavirus humano tipo 16 (HPV16) circulantes en mujeres con infecciones del cérvix en los estados de San Luis Potosí y Guanajuato. MÉTODOS. Empleamos DNA de 50 muestras de exudados cervicales previamente tipificadas en nuestro laboratorio como HPV16-positivas con infección única; 48 provenían de San Luis Potosí y dos de Guanajuato. Obtuvimos amplicones E6/E7 (626 pb) de las 50 muestras mediante PCR anidada con la pareja de oligonucleótidos E6F/PU-2R16 empleando como molde el producto LCR/E7 (650 pb) obtenido en la primera reacción de PCR. En las mezclas de PCR anidadas incluimos tres controles, dos positivos: plásmidos pHPV16 y pHPV18; y uno negativo: mezcla completa sin DNA. Los amplicones fueron secuenciados en el Laboratorio Nacional de Genómica del CINVESTAV-Irapuato. Comparamos las secuencias mediante alineamiento múltiple usando el programa ClustalW . Determinamos los subtipos y las variantes de HPV16 a partir de las secuencias completas del marco de lectura abierto (ORF) del gen E6 (Yamada et al. 1997). Predijimos las secuencias de aminoácidos de la proteína E6 con el programa Translate tool de la base de datos ExPASy. Construimos los dendrogramas de las secuencias de nucleótidos del gen E6 usando el método UPGMA con los programas Phylip y MEGA. RESULTADOS. La longitud promedio de bases secuenciadas, obtenidas de los 50 amplicones E6/E7 de 626 pb, fue 564 ± 63 pb (coeficiente de variación = 11.2%). Pudimos identificar los subtipos de HPV16 en el 98% (49/50) de las secuencias, y las variantes en el 94% (46/49) de las secuencias. Los dos subtipos identificados fueron el Europeo, E (n = 45, 92%) y el Asiático-Americano, AA (n = 4, 8%). Entre las variantes del subtipo E la más frecuente fue la de referencia (E-P) con 31 casos (62%), seguida por la E-350G con ocho casos (16%). Las variantes del subtipo E menos frecuentes fueron las E-C188G (dos casos, 4%) y E-A176G (un caso, 2%). Las variantes del subtipo AA fueron AA-a (dos casos, 4%) y AA-c (dos casos, 4%). Identificamos además 26 mutaciones puntuales adicionales a las de los subtipos y variantes conocidos entre 37 de las 46 secuencias: 16 sustituciones, seis inserciones y cuatro deleciones. La sustitución A404T (no sinónima), apareció en dos secuencias (4.3%), la sustitución A334G (sinónima) en 23 secuencias (50%) y la deleción de dos bases contiguas (AC) en las posiciones 56 y 57 del gen E6 26 pb corriente arriba del codón de inicio del ORF, en 13 secuencias (28.3%). CONCLUSIONES. Las 49 secuencias analizadas del gen E6 identifican los dos subtipos principales de HPV16 circulantes en los estados de San Luis Potosí y Guanajuato: 1) Europeo (n = 45; 90%) y 2) Asiático-Americano (n = 4, 8%)."

"AIM. To identify and to determine the frequency of subtypes and variants of the human papillomavirus type 16 (HPV16) circulating among women with cervical infections in the states of San Luis Potosí and Guanajuato, Mexico. METHODS. DNA from 50 cervical samples infected only with HPV16, previously typified in our laboratory were used; 48 were from San Luis Potosí and two from Guanajuato. From the 50 samples E6/E7 (626 bp) amplicons were generated using nested PCR with the E6F/PU-2R16 primer pair, using as templates the LCR/E7 (650 bp) amplicons obtained in the first PCR. Three PCR controls were included: two positive, pHPV16 and pHPV18; and a negative one: master mix without template. Amplicons were sequenced at the National Genomics Laboratory, CINVESTAVIrapuato, Mexico. Sequences were compared by means of multiple alignment using ClustalW software. HPV16 subtypes and variants were determined from the complete E6 gene open reading frame (ORF) sequences (Yamada et al. 1997). E6-protein amino acid sequences were predicted with the Translate tool software of the ExPASy database. Dendrograms of the E6 ORF nucleotide sequences were generated using the UPGMA method with both Phylip and MEGA software. RESULTS. The average length of the sequences obtained from the 50 E6/E7 amplicons was 564 ± 63 bp (variation coefficient = 11.2%). The HPV16 subtype was identified in 98% (49/50) of all E6/E7 sequences and the variants in 94% (46/49) of the E6 ORF sequences. Two subtypes were identified: 1) European, E (n = 45, 92%) and 2) Asian-American, AA (n = 4, 8%). E-P was the most frequent variant of the E subtype with 31 cases (62%), followed by E-350G with eight cases (16%). The least frequent E subtype variants were E-C188G (two cases, 4%) and E-A176G (one case, 2%). The variants of the AA subtype were two: 1) AA-a (two cases, 4%) and 2) AA-c (two cases, 4%). Twenty-six point mutations additional to those of known subtypes and variants were identified in 37 of the 46 sequences: 16 substitutions, six insertions and four deletions."