Generación de vectores de expresión para el análisis funcional de secuencias reguladoras del Virus Huasteco del Chile

Abstract

"El virus Huasteco del chile (PHV) es un importante fitopatógeno que pertenece a la familia de los geminivirus, los cuales se caracterizan por un genoma circular de DNA de cadena sencilla (DNAcs) y una cápside con apariencia de partícula geminada. Trabajos previos enfocados al estudio del control transcripcional de los genes de diferentes geminivirus, han conducido a la identificación de varios elementos reguladores, dos de los cuales son críticos en el control de la expresión de los llamados “genes tardíos”. Uno de ellos es un silenciador que funciona de modo promotor-específico, y el otro es el llamado “elemento tardío conservado” (CLE), que es un blanco funcional de la proteína viral que activa la expresión de los genes tardíos, como el que codifica a la proteína de la cápside (CP). Este trabajo forma parte de un amplio proyecto de investigación orientado a la caracterización y análisis funcional de secuencias reguladoras del promotor CP de PHV y otros geminivirus. Se generaron cuatro vectores de expresión que contienen fragmentos progresivamente menores de la potencial región silenciadora de PHV, los cuales serán utilizados para definir con mayor precisión la localización genómica del silenciador. Se construyó también una serie de vectores de expresión transitoria y otra de vectores binarios para la transformación de plantas, que contienen diferente número de copias del llamado “elemento tardío conservado” (CLE) fusionados a dos tipos de promotores mínimos; estos vectores permitirán establecer, tanto en sistemas de expresión transitoria como estable, si la multimerización del CLE incrementa la activación del promotor por el transactivador viral (TrAP), y hasta qué límite. Adicionalmente, se desarrolló un análisis filogenético-estructural de la región intergénica de 120 geminivirus, dando como resultado la identificación de nuevos elementos y módulos complejos conservados, que podrían estar involucrados en el control transcripcional del gen CP y otros genes tardíos. El análisis también reveló una serie de conexiones filogenéticas previamente insospechadas entre geminivirus de América y de Asia, las cuales contradicen algunas de las hipótesis más aceptadas acerca de la historia evolutiva de esta familia viral, y sugieren otras con amplias implicaciones biológicas y taxonómicas. Por último, se generaron vectores de expresión que contienen dos de los módulos complejos conservados identificados en el estudio comparativo, fusionados a promotores mínimos que controlan la expresión del gen reportero GUS; dichos vectores permitirán el análisis experimental de esos módulos conservados, proporcionando información importante acerca de la organización funcional del promotor CP de los geminivirus."

"Pepper Huasteco virus (PHV) is an important plant pathogen that belongs to the family of the geminiviruses, which are characterized for a single-stranded circular DNA genome (ssDNA) and virions with appearance of twinned isometric particles. Previous studies on geminivirus transcriptional control of genes have led to the identification of several regulatory elements, two of which are critical in controlling the expression of the so-called “late genes”. One of them is a promoter-specific silencer, and the other one is called the “conserved late element” (CLE), which is a functional target for the viral protein that activates late genes expression, including the gene that encodes the virus coat protein (CP). This work is a part of an extensive research project aimed to delimitate and functionally characterize regulatory sequences of the CP promoter of PHV and other geminiviruses. Four expression vectors containing progressively smaller fragments from the potential silencer region of PHV were generated, which will be used to define more precisely the silencer genomic location. It was also constructed a series of plasmids for transient expression assays, and another one of binary vectors for plant transformation, containing a variable number of copies of the “conserved late element” (CLE), fused to different minimal promoters; these vectors will allow us to establish, both in transient expression assays and stable expression systems, if or not promoter activation by the viral transactivator (TrAP) is dependant on the CLE number of copies. In addition, a phylogenetic-structural analysis of the intergenic region of 120 geminiviruses was carried out, leading to the identification of new putative regulatory elements and “conserved modular arrangements” (CMAs), which may be involved in the transcriptional control of CP gene and other viral genes. Our analysis also revealed previously unsuspected phylogenetic connections between geminiviruses from America and Asia, which disagree with prevalent hypotheses on the evolutionary history of this viral family, and suggest other ones with wide biological and taxonomical implications."