Virus del Papiloma Humano tipo 16 con una deleción de 2.4 Kilobases.

Abstract

"Los genomas de virus del papiloma humano (VPH) que infectan células epiteliales del cuello del útero se replican como episomas de DNA circular de cadena doble de 7,900 pares de bases (pb). Al cuantificar la carga de los genes virales E2 y E6 nuestro laboratorio obtuvo evidencia indirecta de que en las infecciones del cérvix ocurren deleciones aleatorias del genoma de VPH tipo 16 (VPH16). Mediante amplificación por círculo rodante (RCA, rolling circle amplification) los episomas circulares pueden ser copiados como concatémeros lineales -moléculas de DNA constituidas por múltiples copias en tándem de los genomas monoméricos- y el análisis electroforético de los monómeros lineales liberados de los concatémeros por restricción con endonucleasas que reconocen un sitio único podrían distinguirse deleciones genómicas (i.e., copias de tamaño menor al silvestre unitario). Los concatémeros generados mediante RCA también podrían servir de molde para aumentar la amplificación de genomas lineales unitarios mediante PCR de largo alcance (LPCR) con parejas de oligonucleótidos iniciadores divergentes tipo-específicos. MÉTODOS. En este estudio probamos si la RCA seguida de restricción con Bam HI —para la cual hay un sitio único en el genoma de VPH16— o seguida de LPCR –empleando una pareja de oligos divergentes VPH16-específicos y localizados respectivamente al final de la región larga de control y al principio del ORF E6 del genoma de VPH16— permite identificar deleciones de VPH16 en raspados cervicales con infección única por VPH16 diagnosticados mediante PCR multiplex anidada (PCRMA) del oncogén viral E6. RESULTADOS. Después de restringir con Bam HI los concatémeros generados por RCA a partir del DNA de ocho raspados cervicales VPH16-positivos, sólo uno generó productos de amplificación con dos bandas, de 5.5 kilobases (kb) y >10 kb. Al emplearlas por separado en la PCRMA, la banda de 5.5 kb generó el amplicón esperado para VPH16 y la >10 kb los amplicones de VPH16 y VPH18. Dos de las tres mezclas de LPCR con concatémeros preamplificados por RCA —a partir de tres raspados cervicales adicionales VPH16-positivos— dieron la banda única de 7.9 kb esperada para genomas de VPH16 completos. CONCLUSIONES. El raspado con la banda de 5.5 kb está infectado por una deleción de VPH16 de 2.4 kb que no afecta el oncogén E6, el sitio Bam HI y la secuencia de los iniciadores divergentes VPH16-específicos. La banda >10 kb generada en la misma muestra contiene concatémeros de VPH16 y VPH18 no restringidos que identifican una infección por ambos tipos virales. Por lo tanto, la preamplificación del DNA de raspados cervicales VPH16-positivos mediante RCA 1) efectivamente distingue deleciones de los genomas de VPH16 y 2) aumenta la detección de infecciones múltiples; además 3) la RCA seguida de LPCR con iniciadores divergentes tipo-específicos también aumenta la detección de formas episomales de VPH16."

"Human papillomavirus (HPV) genomes infecting epithelial cells of the uterine cervix replicate as double-stranded circular DNA episomes of ~7,900 base pairs. Quantifying the load of the E2 and E6 viral genes our laboratory obtained indirect evidence that random deletions of the HPV type 16 (HPV16) genome occur in cervical infections. By means of rolling circle amplification (RCA) circular episomes may be copied as concatemers —linear DNA molecules consisting of multiple tandem copies of monomeric genomes— and electrophoretic analysis of the linear monomeric genomes released from concatemers by restriction endonucleases recognizing a single site could distinguish genome deletions (i.e., monomer copies smaller that the wild type unitary genome). RCA generated concatemers could also serve as templates to increase amplification of linear unitary genomes by means of long-range PCR (LPCR) with divergent type-specific oligonucleotide primer pairs. METHODS. In this study we tested whether RCA followed by Bam HI restriction —for which there is a single site in the HPV16 genome— or followed by LPCR —using a pair of divergent HPV16-specific primer oligonucleotides located respectively at the end of the long control region and the beginning of the E6 ORF— could identify deletions in cervical scrapes with HPV16 single infection diagnosed by nested multiplex PCR (NMPCR) of the viral oncogene E6. RESULTS. After Bam HI restriction of RCA-generated concatemers from DNA of eight VPH16-positive cervical scrapes, only one generated amplification products and had two DNA bands, of 5.5 kilobase (kb) and >10 kb. Used separately in NMPCR the 5.5 kb band generated the expected HPV16 amplicon and the >10 kb band the HPV16 and HPV18 amplicons. Two of the three LPCR mixtures with RCA-preamplified concatemers —from three additional HPV16-positive cervical scrapes— generated the single DNA band of 7.9 kb expected for complete HPV16 genomes. CONCLUSIONS. The cervical scrape with the 5.5 kb band is infected by a 2.4 kb HPV16 deletion that does not affect the E6 oncogene, the Bam HI site and the HPV16-specific divergent primer sequences. The >10 kb band generated by the same sample corresponds to unrestricted HPV16 and HPV18 concatemers and identifies infection with both viral types."