Expresión de interferón gamma humano y la proteína verde fluorescente en E. coli usando el sistema de autotransporte ShdA.

Abstract

"La exportación de proteínas recombinantes en Escherichia coli, ya sea ancladas o liberadas fuera de la membrana externa es de gran utilidad en muchas aplicaciones biotecnológicas. En bacterias Gram–negativas se conocen siete vías de secreción de proteínas y una adicional auxiliada por chaperonas, de ellas la vía V llamada de los ‘Autotransportadores’ es la más simple. Los autotransportadores de Salmollela sp, MisL y ShdA, comparten con AIDA-I, de E. coli, alrededor de un 30% de identidad. El autotransportador AIDA-I ha demostrado ser una herramienta útil para el transporte de proteínas. En el presente trabajo se estudió la expresión de dos proteínas de fusión, LTB-hIFN-ShdA, LTB-GFP-ShdA para evaluar si el autotransportador ShdA permite la translocación de la proteína verde fluorescente (GFP) y el interferón gamma humano (hIFN-) fuera de la membrana de E. coli. Las secuencias se subclonaron en pET-12. Las cepas BL21SI, BL21(DE3)-pLysS y BL21(DE3)-pRARE se transformaron y se encontró que las proteínas de fusión, LTB-GFP-ShdA y LTB-hIFN-ShdA, son tóxicas para el metabolismo de las cepas usadas en este trabajo. El cambio de temperatura, medio de cultivo y coexpresión de las cepas con pRARE no aumentó significativamente la expresión de las fusiones. Finalmente la proteína LTB-hIFN-ShdA no se detectó fuera de la membrana externa de E. coli. Esto sugiere que la proteína se encuentra anclada en la membrana interna y en cuerpos de inclusión citoplásmicos"

"Recombinant protein display at cellular surface in Escherichia coli is useful for many biotechnical applications. In Gram–negative bacteria seven secretion systems are recognized along with an additional the chaperone usher. The system V termed ‘Autotransporters’ is the simplest mechanism. The Salmonella’s autotransporters, MisL and ShdA share 30% identity with AIDA-I. AIDA-I is an E. coli’s autotransporter and it has been demonstrated to be an useful tool for protein display. The aim of this study was to evaluate whether the ShdA system is suitable to translocate, the human interferon gamma (hIFN-) and the green fluorescent protein (GFP), toward out membrane in E. coli. We focused on the expression of two fusion proteins: LTB-hIFN-ShdA and LTB-GFP-ShdA. The DNA sequences of those fusions were subcloned into the pET-12 vector expression system. BL21SI, BL21(DE3)-pLysS and BL21(DE3)-pRARE were used as host strains. The findings showed that LTB-GFP-ShdA and LTB-hIFN-ShdA were toxic to the strains tested. Changes in temperature, medium and co-expressing pRARE in host strains did not significantly improve the quantity and quality of protein expression. Finally LTBhIFN  ShdA was not detected toward the outer membrane in E. coli this suggests that the protein is could be anchored to the inner membrane and in cytoplasmic inclusion bodies."