Estudio estructura función del activador transcripcional SdrP de Thermus thermophilus

Abstract

"La transcripción es un proceso altamente regulado que ocurre en todos los organismos vivos. En Thermus thermophilus, una de las proteínas encargadas de regular este proceso es la proteína dependiente de la fase estacionaria (SdrP, por sus siglas en inglés) SdrP es miembro de la familia CRP/FNR, es homólogo estructural de la proteína activada por catabolito (CAP) con un RMSD de 2.7 Á. CAP Y SdrP reconocen secuencias de DNA prácticamente idénticas. Sin embargo, SdrP no rquiere ser activada para reconocer su sitio de unión en el DNA. En el caso de SdrP, se han reportado las secuencias de DNA que reconoce, los genes que activa e incluso se ha resuelto su estructura tridimensional en ausencia de ligandos. No obstante aún no se ha descrito el mecanismo por el cual SdrP reconoce e interacciona con su sitio de unión en el DNA. En este trabajo se purificó a SdrP como proteína recombinate en Escherichia coli. Con la proteína pura, se analizó su capacidad de reconocer una secuencia consenso de DNA de 38 pb, utilizando un ensayo de movilidad seguido por cromatografía de exclusión molecular. Se analizó su estabilidad térmica en presencia y ausencia de trehalosa, monitoreando la fluorescencia intrínseca de la proteína y la fluorescencia de la molécula ácido 8-anilimo-1naftaleno sulfónico (ANS). Se realizaron ensayos de cristalización del complejo SdrP:DNA38, utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Con los cristales obtenidos se realizaron experimentos preliminares de difracción de rayos X. Los resultados de estabilidad térmica muestran que SdrP sigue un proceso de desnaturalización de tres estados. Los ensayos de movilidad seguidos por filtración en gel, demuestran que la proteína SdrP reconoce y se une al fragmento de DNA de 39 pb formando el complejo SdrP:DNA. Con este complejo, se obtuvieron cristales en 11 condiciones diferentes, de los cuales, uno de ellos difrada aproximandamente a 15 Á"

"Transcription is a highly regulated process that takes place in all living organisms. In the thermophilic bacteria Thermus thermophilus, one of the proteins that regulate this process is the Stationary Phase Dependent Regulatory Protein (SdrP). SdrP is a member of the CRP/FNR transcription factor family; SdrP has 23% of amino acid sequence identity and a RMSD of 2.7 Å with the Catabolite- Activated-Protein (CAP), which is the best-known member of the family. CAP and SdrP recognize practically the same DNA sequence, nevertheless, SdrP doesn´t need to be activated to recognize its binding site on the DNA. For SdrP, it has been reported the DNA sequences that recognizes, the genes that activates and the crystal structure without ligands. However, the mechanism by which SdrP recognizes and interacts with the DNA has not been described. In this work SdrP was purified as recombinant protein in Escherichia coli. With the purified protein, we analyzed the ability of SdrP to bind a 38 pb consensus-DNA sequence, through a mobility shift assay, using size exclusion chromatography. The thermal stability was analyzed with and without trehalose, by monitoring the intrinsic fluorescence of the protein and the fluorescence of the molecule 8-anilin-1-naftalene sulfonic acid (ANS). The crystallization assay of the complex SdrP:DNA was setup by the sitting drop vapor diffusion technique. With the obtained crystals, preliminary X-ray diffraction experiments were performed. The thermal stability results show the denaturation process of SdrP follows a three state model. The mobility shift assay followed by gel filtration shows that SdrP protein recognizes and binds to the 38 bp DNA sequence, allowing us to get the SdrP:DNA complex. Crystals of the complex were obtained in eleven different conditions, one of them diffracted at 15 Å."