Gen sintético que codifica péptidos antigénicos del virus sincicial respiratorio: diseño y expresón en sistemas vegetales

Abstract

"El virus sincicial respiratorio (VSR) es el principal patógeno de tracto respiratorio bajo en niños de todo el mundo. La infección por VSR causa cerca de 100,000 hospitalizaciones en Estados Unidos, con costos que ascienden a $300 millones de dólares anuales. A pesar de la importancia del VSR como un patógeno respiratorio, no existe actualmente una vacuna disponible en el mercado. Este trabajo se enfocó al desarrollo de construcciones que codifiquen epítopos antigénicos de las proteínas F, G Y M del VSR optimizados para su expresión estable en citoplasma y los cloroplastos de las platas, así como para su expresión transitoria mediante vectores virales para su producción con altos niveles. Se diseñó una construcción genética pBI-VSRn que consta de cuatro epítopos del VSR (dos de la proteína F, uno de la proteína G y uno de la proteína M) optimizada para el uso de codones en plantas y cuenta además con espacios ricos en prolina y con una región del virus del sarampión; esto último con la finalidad que influya en el balance de respuesta Th1/Th2; que ha sido una limitante en trabajos previos en el desarrollo de vacunas contra VSR. Con esta construcción se se realizó la transformación genética de plantas de tabaco y lechuga via Agrobacterium tumefaciens, lográndose obtener callos y brotes resistentes al agente de selección; de los cuales se pudieron analizar por PCR los callos de lechuga demostrándose la presencia del transgén en 6 de 15 muestras analizadas. Se inició además la transformación de cloroplastos de tabaco mediante el método de biobalística y estamos en el proceso de obtención de brotes. Por otra parte se usó por primera vez en nuestro grupo de trabajo la técnica de transformación transitoria mediada por vectores virales denominada ¨Magnifection¨, la cual tiene ventajas de transfección por Agrobacterium y la alta tasa de replicación viral y por ende de producción de proteína recombinante en 4 semanas. Mediante esta técnica se logro la transformación genética de plantas de tabaco con la construcción pICH-VSRn, obteniéndose resultados positivos para la presencia del transgén mediante PCR. Aunado a lo anterior, se llevó a cabo el diseño de un gen sintético que codifica un péptido con actividad antiviral (Rho A) contra el VSR, con el objetivo de buscar alternativas adicionales al control de la replicación del virus. Finalmente se logró la regeneración in vitro de platas de soya, con el fin de utilizar este sistema vegetal para futuras transformaciones genéticas, en las cuales se peuda obtener de manera estable una mayor proporción de proteína total soluble con mayor vida de anaquel. Los materiales obtenidos por transformación transitoria serán analizados in vitro e in vivo para ver su antigenicidad e inmunogenicidad y el balance de respuesta inducida Th1/Th2, así como los materiales resultantes de la transformación nuclear y de cloroplastos."

"Respiratory syncytial virus (RSV) is the major cause of lower respiratory tract infections in children worldwide. VSR infections cause around 100,000 hospitalizations in the USA, with costs of more than $300 million dollars per year. However, in spite of RSV importance as a respiratory pathogen, still, there is no a successful vaccine in the market. In this work, we developed a set of constructions encoding plant-optimized sequences of epitopes derived from the antigenic F, G and M proteins of RSV. These vectors were optimized for stable plant transformation in order to obtain the transgene expression into nuclear and chloroplast genome and also for viral-based transient expression. The pBI-VSRn vector carries four RSV epitopes (two from the F protein, one from the G protein and one from the M protein), which were optimized for codon usage in plants. This construct also has proline-rich linkers and a measles virus region that is though may balance the Th1/Th2 immune response, which has been a limiting factor in previous works on the development of vaccines against RSV. With this plasmid, the genetic transformation of tobacco and lettuce plants via Agrobacterium tumefaciens was performed. We obtained callus and shoots for both plants resistant to the selection marker, and the presence of the transgene in six of the fifteen lettuce shoots was demonstrated by PCR assay. As for tobacco chloroplast transformation, the pBIC-VSRc plasmid was bombarded and calli are under development. In the other hand, the “Magninfection” technique, a viral-based transient expression system, was used for the first time by our research group. Here we exploit the advantages of Agrobacterium-mediated delivery of viral vectors, which have high replication rate resulting in a systemic transfection of a plant and therefore in high yields of recombinant proteins in short time. Using this technique, tobacco plants were transformed with the construct pICH-VSRn and the transgene presence was confirmed by PCR analysis. In addition, we designed a synthetic gene that encodes a peptide (Rho A) with antiviral activity against RSV, as an approach to search new alternatives for the RSV virus replication control. Finally, in vitro plant regeneration of soybean was achieved. This method will be used as an alternative for future plant genetic transformation, because seeds offer higher protein yield production total soluble protein with longer shelf life than other plant systems. The tobacco and lettuce obtained in this work, will be analyzed in vitro and in vivo assays for their antigenicity and immunogenicity respectively, focusing in the Th1/Th2 balance of the immune response induced in the in vivo assays."