Expresión y análisis de actividad biológica de un péptido antimicrobiano Protegrina-1 producido en tabaco por dos sistemas de transformación genética

Abstract

"El uso inadecuado de antibióticos para tratar enfermedades infecciosas se está convirtiendo en un problema de salud pública, al favorecer la emergencia de cepas bacterianas con resistencia a los antibióticos de uso común. Por lo tanto, los antibióticos alternativos son esenciales para estos tratamientos. Los péptidos antimicrobianos, como la protegrina-1 (PG-1), son una interesante alternativa para hacer frente a este problema. La PG-1 es un péptido antimicrobiano de amplio espectro de origen porcino. En este estudio, se utilizó un sistema de expresión transitoria llamado magnICON, así como la transformación de cloroplastos, con el fin de expresar PG-1 en tabaco (Nicotiana tabacum). En los experimentos de magnICON se utilizaron ensayos de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar el replicón viral activo, generando un amplicón de 290 pb, en tanto que en el análisis de transferencia de ARN por la técnica de Northern blot se detectó un producto de 6.1 kb. El análisis de proteína soluble total por medio de geles de SDS/PAGE reveló la presencia de una banda correspondiente al peso molecular de la PG-1 (2.1 kDa), que estaba ausente en el extracto silvestre de tabaco. Se realizaron ensayos antimicrobianos usando el extracto de proteínas de tabaco transformadas transitoriamente, los cuales demostraron que la actividad del péptido (PG-1) en los tejidos de la planta era factible y contribuyó a la inhibición de 53.2% de Klebsiella pneumoniae, 70.2% de Staphylococcus aureus, 56.6 % de Escherichia coli, 72% de Mycobacterium bovis BCG, y 70% de los cultivos de Candida albicans, lo cual no se detectó en extractos silvestres de tabaco. Además se expresó la protegrina-1 (PG1) por biobalística en cloroplasto de tabaco. Se usó un vector bicistrónico modificado a partir del vector pKCZ, con el promotor Prrn y la región 5'UTR de la proteína 10 del fago T7, así como el gen de PG-1 fusionado traduccionalmente a la ubiquitina (Ub::PG-1). El gen (aadA) se incluyó como un marcador de selección. Se bombardearon hojas jóvenes de tabaco, y tras dos rondas de selección se obtuvieron probables plantas transplastómicas que fueron evaluadas por RT-PCR para confirmar la transcripción del transgén. La producción del péptido Ub::PG-1 se confirmó por ensayos de Western-blot usando un anticuerpo anti-ubiquitina. El extracto proteico redujo el crecimiento de los cultivos de K. pneumoniae en un 87.5%, de S. aureus en un 78.7%, de E. coli en un 66.8%, de M. bovis en un 88.8% y de Clavibacter michiganensis (Cmm) en un 57.8%. Además, se realizó un ensayo de infección contra Cmm en plantas de tabaco transplastómicas que expresan la PG-1; los resultados mostraron una clara disminución de los síntomas desarrollados, en comparación con la planta silvestre. Por lo tanto, la PG-1 producida tanto en células de plantas de tabaco infiltradas como en cloroplastos transformados, es funcionalmente activa y capaz de reducir el crecimiento de varios patógenos humanos y de plantas."

"Mammalian infectious diseases are widespread, and some are becoming difficult to control due to inappropriate use of antibiotics. This has contributed to the incidence of bacterial strains with resistance to commonly used antibiotics. Thus, effective alternative antibiotics are essential for treatment of infectious diseases. Antimicrobial peptides are viable alternatives to address this problem. Among those, protegrin-1 (PG-1) is a broad-spectrum antimicrobial peptide. In this study, a magnICON and chloroplast transformation systems were used to express the PG-1 peptide in Nicotiana tabacum. For the transient expression system mediated by Agrobacterium (magnICON), reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RTPCR) and Northern blot analyses of transformed N. tabacum were employed to detect viral replicons, 290 bp and 6.1 kb. SDS/PAGE revealed the presence of a band corresponding to the molecular weight of PG-1 (2.1 kDa), which was absent in wild-type N. tabacum. Antimicrobial/antifungal assays of protein extracts from transiently transformed N. tabacum were performed, and these demonstrated that PG-1 peptide activity in these plant tissues was viable and contributed to inhibition of 53.2 % of Klebsiella pneumoniae, 70.2 % of Staphylococcus aureus, 56.6 % of Escherichia coli, 72 % of Mycobacterium bovis BCG, and 70 % of Candida albicans cultures. No inhibition of any of these fungal and bacterial pathogens was detected when wild-type N. tabacum extracts were used. In addition we expressed the protegrin-1 (PG1) encoded by a synthetic gene optimized in its codon-usage for tobacco chloroplast expression (N. tabacum var. Petit Havana), using a biolistic method. A bicistronic vector modified from pKCZ was obtained with the Prrn promoter and 5'UTR region of the protein 10 from phage T7, as well as the Protegrin-1 (PG-1) gene fused to ubiquitin. The (aadA) gene was included as a selection marker. Particle bombardment was used in tobacco young leaves and after two rounds of selection, transplastomic plants were obtained. Putative transplastomic lines were evaluated by RT-PCR. The presence of ubiquitinprotegrin protein production was confirmed by Western-blot assay. The protein extract reduced the growth cultures of K. pneumoniae 87.5%, S. aureus 78.7%, E. coli 66.8%, M. bovis 88.8% and Clavibacter michiganensis (Cmm) 57.8%."