Purificación, análisis de estabilidad térmica y ensayos de cristalización de la proteína G0S2 de humano

Abstract

"G0S2 is a basic protein of 103 amino acids. To date, the best-known function of G0S2, is the inhibitory effect that it has on the activity of the lipolytic enzyme, adipose triglyceride lipase (ATGL). Although, G0S2 has also been related to various biological activities, including roles in cell cycle, cell proliferation, apoptosis, inflammation and carcinogenesis. That is why, the elucidation of the 3D structure of G0S2 would be a significant contribution to address issues specifically on the regulation of ATGL, as well as their participation in important aspects in lipolysis and other cellular processes. In order to obtain the experimental three-dimensional structure of G0S2, we expressed human G0S2 (hG0S2) as a fusion protein with SUMO protein of S. cerevisiae in E. coli with the expression vector, pETSUMO. The fusion protein SUMO-hG0S2 was found to be soluble and its purification was carried out using IMAC, ion exchange and gel filtration chromatography, the hG0S2 was released by proteolysis with PPS. We obtained protein concentrations of 10 and 5 mg/mL for the SUMO-hG0S2 and hG0S2 proteins, respectively, which allowed us to set the first crystallization trials. Finally, we found by thermofluor approach that the use of 10% glycerol, and pH 6.5 has a positive impact on hG0S2 thermal stability, which provides a good starting point to optimize purification and crystallization conditions that should let us characterize the structure of hG0S2."

"G0S2 es una proteína básica de 103 aminoácidos. Hasta la fecha, la función mejor conocida de G0S2 es su capacidad inhibitoria directa sobre la enzima lipolítica triglicérido lipasa de tejido adiposo (ATGL). Aunque también se le han asignado diversas actividades biológicas, incluyendo papeles en el ciclo celular, proliferación celular, apoptosis, inflamación y carcinogénesis. Es por esto que dilucidar la estructura y las funciones con más precisión de G0S2 sería de gran aporte para poder abordar cuestiones específicamente sobre la regulación de ATGL, así como también su participación en aspectos importantes en la lipólisis y otros procesos celulares. Con el objetivo de obtener la estructura tridimensional experimental de G0S2, expresamos G0S2 humana (hG0S2) como proteína de fusión con la proteína SUMO de S. cerevisiae en E.coli mediante el vector de expresión pETSUMO. La proteína de fusión SUMO-hG0S2 y su producto de proteólisis hG0S2 fueron solubles y se purificaron por cromatografías de afinidad, intercambio iónico y exclusión molecular. De estas dos formas de la proteína Obtuvimos concentraciones de proteína de 10 y 5 mg/mL, respectivamente, lo que permitió realizar los primeros ensayos de cristalización. Finalmente, observamos que el uso de glicerol al 10% y pH 6.5 tienen un impacto positivo en la estabilidad térmica de hG0S2, lo que nos proporciona un buen punto de partida para buscar la optimización de condiciones para su cristalización y poder caracterizar la estructura de hG0S2."