Expresión inducible de fusiones traduccionales de los genes MTL de Candida glabrata

Abstract

"Sexual reproduction in most fungi is controlled by genes encoded in the MAT locus (Mating Type Locus) or MTL (Mating-Type Like) in other fungi. In Saccharomyces cerevisiae these genes encode transcription factors involved in the establishment of the cell-type identity and regulation of mating. Candida glabrata is a haploid and asexual yeast that is an opportunistic pathogen of humans. However, it has orthologous genes to those that regulate mating in S. cerevisiae, called a1, alpha1 and alpha2 encoded in the MTL loci. The fact that C. glabrata has preserved these genes, even though there is no experimental evidence of sexual reproduction, raises the question of what is the role of these genes in this organism. To elucidate the function of these genes, we have generated four different replicative recipient vectors in C. glabrata, that allow us to generate translational fusions with two different epitopes (Flag or c-Myc) or two fluorophores (mCherry or YFP), at either the C or N-termini of the genes of interest. These plasmids are replicative in C. glabrata and have different selection markers to allow for selection of two plasmids in a single cell, and coexpression of two different tagged proteins. In addition the vectors contain one of two inducible promoters: the promoter of either MET3 or MT1 genes, so it is possible to tag the genes of interest at either end and induce the fusions by growing in specific media. We generated different translational fusions of the MTL genes at the carboxy and amino termini with both fluorophores and epitopes used in this work. We will use these fusions to identify the cellular localization of these proteins (in the case of genes tagged with fluorophores), as well as studies of DNA-protein interaction (ChIP, ChIP-seq) and protein-protein interactions by co-expression of different genes in the same cell (CoIP). In parallel, we have cloned each wild-type gene (with no epitope or fluorophore fusion) under the inducible promoter PMT1 to study the effect of the over-expression of these genes."

"La reproducción sexual y el control de la identidad del tipo celular sexual en la mayoría de los hongos está regulada por los genes codificados en el locus MAT (mating type locus) o MTL (mating type like) en otros hongos. Candida glabrata es una levadura haploide y asexual. Sin embargo, contiene en su genoma tres loci MTL en los cuales codifica los genes ortólogos a los que regulan el apareamiento en Saccharomyces cerevisiae, denominados a1, alfa1 y alfa2. El hecho de que C. glabrata haya conservado estos genes aun cuando no existan hasta el momento evidencias experimentales de reproducción sexual, plantea la pregunta de cuál es la función de estos genes en esta levadura. Para el estudio de la función de estos genes, hemos generado cuatro vectores replicativos en C. glabrata que nos permitirán construir fusiones traduccionales con dos epítopos diferentes (Flag o c-Myc) o con dos fluoróforos (mCherry o YFP), tanto en el extremo carboxilo como el amino de los genes de interés. Los vectores además contienen un promotor inducible, el del gen MET3 o del gen MT1, de manera que es posible etiquetar los genes de interés en cualquiera de los extremos e inducirlos mediante el crecimiento en medios específicos. Hemos generado diferentes fusiones traduccionales donde los genes codificados en los loci MTL ya se encuentran etiquetados en el extremo carboxilo y amino terminal con fluoróforos o epítopos de estos vectores. Con estas construcciones realizaremos ensayos para identificar la localización celular de las proteínas codificadas por estos genes (para los genes etiquetados con fluoróforos), así como estudios de interacción DNAproteínas (ChIP, ChIP-seq) e interacción entre proteínas (CoIP) mediante la coexpresión de diferentes genes etiquetados. Paralelamente, para realizar estudios de la función de estos genes hemos clonado los genes silvestres de interés (sin fusiones traduccionales) bajo el promotor inducible PMT1 para determinar el fenotipo de la sobreexpresión de cada uno de estos genes."