Análisis estructural y funcional de la proteína Clp de Xanthomonas axonopodis pv. citri

Abstract

"Clp (Crp-like protein) es un regulador de la expresión de factores de virulencia en la bacteria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri, fitopatógeno causante del cáncer de los cítricos y de gran importancia económica. Este factor de transcripción pertenece a la familia CRP/FNR presentando 45% de identidad de secuencia con CAP (por sus siglas del inglés Catabolite Activator Protein), sin embargo es único en su clase por dos cuestiones. En primer lugar es capaz de unirse al ADN sin necesidad de unirse a su ligando, y esta unión a ligando solo provoca su inhibición. Además el ligando que une es c-di-GMP, a diferencia de la mayoría de los integrantes de la familia que unen AMPc como es el caso de CAP. Nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional del complejo Clp-ADN. Para esto se expresó Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Echerichia Coli, induciendo la expresión de la proteína con 0.4 mM de IPTG a 28 ⁰C durante 16 horas tras un choque frio de 2 horas. La purificación se realizó mediante tres pasos cromatográficos, IMAC, intercambio iónico y por último exclusión molecular. El proceso tuvo un rendimiento final de 0.6 mg/litro de cultivo. La proteína Clp recombinante obtenida presentó actividad biológica evaluada por un ensayo de movilidad monitoreado mediante exclusión molecular, mostrándose que el tiempo de retención del complejo Clp-ADN disminuye (10 mL = 197242 Da) con respecto al ADN solo (11.8 ml = 65493 Da). Por análisis de Thermofluor se observó que el cloruro de sodio, el glicerol, el cloruro de litio y el ácido glutámico aumentaron la estabilidad térmica de Clp."

"The Crp-like protein (Clp) is a global regulator of the expression of virulence factors in gram negative bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri. phytopathogen that causes citrus cancer, which is economically important. This factor belongs to the CRP / FNR family and presents 45% of sequence similarity with Catabolite Activator Protein (CAP). However it is unique in its class for two reasons: first, it is able to bind DNA without binding to its ligand, and the ligand binding causes inhibition. Furthermore, the binding ligand is c-di-GMP, unlike most family members, such as CAP, that bind cAMP. Our goal is to solve the threedimensional structure of Clp-DNA complex. Clp was expressed in the BL21 (DE3) Star Escherichia coli strain, inducing protein expression with IPTG 0.4 mM at 28 ⁰C for 16 hours after a cold shock for 2 hours. Purification was performed by three chromatographic steps, IMAC, ion exchange and lastly molecular exclusion. The process had a final yield of 0.6 mg / liter of culture. Recombinant Clp obtained presented biological activity evaluated by size-exclusion mobility shift assay, showing that the retention time of the Clp-DNA complex decreases (10mL = 197,242 Da) compared to DNA alone (11.8ml=65,493Da). Sodium chloride, glycerol, lithium chloride and glutamic acid increased the thermal stability of Clp."