Análisis funcional y estructural de la proteína Clp de Xanthomonas campestris pv. campestris

Abstract

"Clp (Crp-like protein) es el factor de transcripción global de la virulencia en la bacteria Gram negativa Xanthomonas campestris pv. campestris, fitopatógeno de una gran relevancia económica. A pesar de pertenecer a la superfamilia de factores de transcripción de CAP, Clp es único en su clase al no requerir de un modulador alostérico para ser capaz de unirse al DNA. De hecho, su ligando el cdi-GMP actúa como inhibidor al producir cambios alostéricos en la estructura terciaria de Clp. Estas características y la poca homología a nivel de secuencia y estructura con otros efectores de c-di-GMP hacen de Clp un factor de transcripción único. Nuestro objetivo es resolver la estructura tridimensional del complejo Clp-DNA. Como parte de nuestro diseño experimental, expresamos Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli utilizando el vector pET28pps La inducción se realizó con 0.2 mM de IPTG a 37 ºC por 8 horas tras un choque frío de 2 horas a 4 ºC. La purificación por cromatografía de afinidad a níquel en un amortiguador optimizado con 250 mM de NaCl, 100 mM de LiCl y 20 mM de Tris a pH 8.0 presentó un rendimiento de purificación de 3mg/L. Por análisis de Thermofluor se observó que el NaCl y el LiCl aumentaron la estabilidad térmica de Clp. El ensayo de movilidad por cromatografía de exclusión molecular mostró que el tiempo de retención disminuye para el complejo Clp-DNA (12.18 min = 242391 Da) con respecto al DNA por sí solo (19.10 min = 11329 Da). Las primeras pruebas de cristalización del complejo Clp-DNA mostraron una proporción de 23.2% de precipitados. De forma paralela se logró la subclonación de CAP en el vector pET28pps, la expresión y purificación arrojó un rendimiento de 24 mg/L. Esto servirá para un análisis comparativo de la interacción con el DNA de Clp y CAP por microscopía de fuerza atómica."

"Crp-like protein (Clp) is the virulence global transcription factor of the Gram negative bacteria Xanthomonas campestris pv. campestris, phytopatogen of great economic relevance. Even though it belongs to the CAP transcription factors superfamily, Clp is unique because it does not require an alosteric modulator for the binding to DNA. In fact, its ligand, c-di-GMP acts in an inhibitory way by triggering alosteric changes on Clp tertiary structure. These characteristics and the low structure and sequence homology with others c-di-GMP effectors make of Clp a unique transcription factor. Our main goal was to obtain the Clp-DNA tertiary structure. Experimental design consist in Clp expression on the pET28pps vector using Escherichia coli BL21 (DE3) Star cells. Expression was induced with IPTG 0.2 mM, 8h at 37 ºC after a thermal shock of 2 h at 4 ºC. Immobilized metal ion affinity chromatography purification on a NaCl 250 mM, LiCl 100 mM and Tris-HCl 20 mM, pH 8.0 buffer showed a 3 mg/L performance. NaCl and LiCl increased Clp thermal stability as observed by Thermofluor. Size-exclusion chromatography movility shift assay (SEC-MSA) showed that the retention of the Clp-DNA complex decreased (12.18 min = 242391 Da) in accordance to the DNA by its own (19.10 min = 11329 Da). The first crystallization trials for the Clp-DNA complex showed a 23.2% precipitates proportion. CAP transcription factor was also cloned in the pET28pps vector, protein expression and purification were achieved with a 24 mg/L performance. The protein-DNA interaction of both Clp and CAP with DNA will be analyzed and compared by means of atomic force microscopy."