Purificación, caracterización bioquímica y cristalización de la enzima XanA y dos variantes truncas en el extremo N-terminal

Abstract

"In the metabolism of purines, degradation of xanthine to uric acid is mediated by the enzyme xanthine oxidase. However, in 2005, a novel mechanism for xanthine metabolism was discovered, this mechanism is mediated by the enzyme xanthine hydroxylase (XanA), which is Fe2+ and α-ketoglutarate-dependent. This pathway is exclusive of certain fungi as A. clavatus, in some yeast as C. albicans, S. pombe and in the genera Penicillium and Taleromyces, among others. XanA is an enzyme of 370 amino acids and 41.3 kDa, which presents an 18% identity with the enzyme taurine/ α-CG dioxygenase (TauD). The catalytic mechanism has not yet been described and it belongs to the group of the hydroxylases dependent on Fe2+ and α-ketoglutarate, XanA is the first enzyme described of this group that hydroxylates a free purine base .The three-dimensional structure of XanA enzyme has not yet been reported; therefore, the aim of this work was to characterize and crystalize the XanA protein. The protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) Star cells using 0.4 mM IPTG. Purification of the wild type enzyme was carried out in two steps, IMAC and size exclusion chromatography, with a final yield of 15 mg/L. Enzyme kinetics studies of XanA wild type enzyme show that the enzyme fits the Michaelis-Menten equation with a Km of 97.9 ± 13.9 μM for α-ketoglutarate. We perform crystallization trials with wild type XanA (monomeric), and obtained an approach to appropriate conditions to obtain crystals"

"En el metabolismo de las purinas la degradación de xantina a ácido úrico es mediada por la enzima xantina oxidasa. Sin embargo, en el 2005 se describió una nueva vía de degradación alternativa en Aspergillus nidulans mediada por la enzima xantina dioxigenasa dependiente de Fe2+ y α-cetoglutarato (α-CG, XanA). Esta vía, es exclusiva de hongos como A. clavatus, en algunas levaduras como C. albicans, S. pombe y en los géneros Penicillium y Taleromyces, entre otros. XanA es una enzima de 370 residuos de aminoácidos y 41.3 kDa, que presenta un identidad del 18% con la enzima taurina/ α-CG dioxigenasa (TauD). El mecanismos catalítico de XanA aún no ha sido descrito y dentro del grupo de las hidroxilasas dependientes de Fe2+ y α-CG, es la única capaz de hidroxilar una purina libre. La estructura tridimensional de la enzima XanA aún no ha sido reportada, por lo tanto el objetivo de este trabajo es caracterizar y cristalizar la proteína XanA. La proteína fue expresada en la cepa BL21 (DE3) Star de E.coli utilizando 0.4 mM de IPTG. La enzima se purificó en dos etapas, IMAC y filtración en gel, con un rendimiento final de 15 mg/L. Los estudios de cinética enzimática muestran que la enzima XanA silvestre es activa y su cinética se ajusta a la ecuación de Michaelis-Menten con una Km para el α-CG de 97.9 ± 13.9 μM. Realizamos ensayos de cristalización con XanA silvestre (monomérica), y obtuvimos una aproximación a las condiciones adecuadas para obtener cristales."