Evolución forzada de geminivirus: inestabilidad de mutaciones en la hélice-4 del dominio de unión a Retinoblastoma de la proteína Rep

Abstract

"In the last decade, several studies of the evolutionary potential of viruses with single-stranded DNA genomes (ssDNA), such as parvoviruses and circoviruses, have shown that nucleotide substitution rates are higher than those of viruses with double-stranded DNA genomes (dsDNA), and in some cases resemble the observed mutation rates in RNA viruses. Geminiviruses are plant pathogens distributed worldwide and are responsible for major losses in agriculture. They have ssDNA genomes and replicate by the rolling circle mechanism (RCR), like nanoviruses and circoviruses. The geminivirus Rep protein is a multifunctional protein which is essential for viral replication. It has been shown that Rep proteins of TGMV and CaLCuV interact with retinoblastoma protein (pRBR), a regulator of cell cycle in plants, through a motif of 11 amino acids, called “helix-4”. Certain substitutions in the conserved residue (Leu) located in the center of the helix-4, caused a delayed onset of symptoms with a very high frequency, although the symptoms were similar to those caused by the wild type virus. The analysis of the viral progeny recovered from these plants revealed the emergence of new viral genotypes in the course of infection. Most of them showed changes in the original mutation, resulting in codons for Leucine (direct reversion), Methionine and Isoleucine (functional reversion). In this study we have examined the effect of equivalent substitutions in the Rep proteins of three begomoviruses with a distant phylogenetic relationship: Pepper golden mosaic virus (PepGMV), Pepper huasteco yellows vein virus (PHYVV) and Tomato mottle Taino virus (ToMoTV). The infectivity assays with mutant viruses in Capsicum annuum and Nicotiana benthamiana plants led to several interesting conclusions: a) the effect of mutations in the conserved residue of the helix-4 depends on the viral genetic background, b) some mutations are stable whereas others are reversed with a unusual high frequency by changing the site of the original mutation, or through compensatory mutations in different codons (suppressor mutations), c) genetic alterations that restore the function of mutant Rep proteins involved only three codons of the Rep gene, and are basically the same in pepper and N. benthamiana"

"En la última década varios estudios del potencial evolutivo de virus con genomas de DNA de cadena sencilla (ssDNA), como parvovirus y circovirus, han mostrado que las tasas de substitución nucleotídica son más altas que las de virus con genomas de DNA de doble cadena (dsDNA), y en algunos casos se asemejan a las tasas de mutación observadas en virus de RNA. Los geminivirus son fitopatógenos que se encuentran distribuidos en todo el mundo y son responsables de grandes pérdidas en la agricultura. Poseen genomas de ssDNA, y al igual que los nanovirus y los circovirus, se replican por el mecanismo de Círculo Rodante (RCR). La proteína Rep de geminivirus es multifuncional y esencial para la replicación viral. En los virus TGMV y CaLCuV se ha demostrado que Rep interactúa con la proteína Retinoblastoma (pRBR), un regulador del ciclo celular en plantas, mediante un motivo de 11 aminoácidos, denominado ¿hélice-4¿. Ciertas substituciones en un residuo conservado (Leu), ubicado en la parte central de la hélice-4, ocasionaron un retraso en la aparición de síntomas con una frecuencia muy alta, aunque los síntomas fueron similares a los causados por el virus silvestre. El análisis de la progenie viral recuperada de esas plantas reveló la aparición de nuevos genotipos virales en el curso de la infección. La mayoría de ellos mostraron cambios en la mutación original, dando lugar a codones para Leucina (reversión directa), Metionina e Isoleucina (reversión funcional). En este trabajo hemos examinado el efecto de substituciones equivalentes en la proteína Rep de tres begomovirus filogenéticamente distantes: el virus del mosaico dorado del chile (PepGMV), el virus huasteco del amarillamiento de las venas del chile (PHYVV) y el virus Taino del moteado del tomate (ToMoTV). Los ensayos de infectividad de los virus mutantes en plantas de Capsicum annum y Nicotiana benthamiana condujeron a varias conclusiones interesantes: a) el efecto de las mutaciones en el residuo conservado de la hélice-4 depende del fondo genético viral, b) algunas mutaciones son estables y otras revierten con frecuencia inusualmente alta mediante cambios en el sitio de la mutación original, o por medio de mutaciones compensatorias en codones diferentes (mutaciones supresoras); c) las alteraciones genéticas que restauran la función de las proteínas Rep mutantes involucran solo a tres codones del gen Rep, y son básicamente las mismas en infecciones de chile y N. benthamiana, aunque su frecuencia relativa parece ser dependiente del huésped; d) las poblaciones de geminivirus presentan características de cuasi-especies, por la existencia de varios genotipos en una misma planta. En conjunto, nuestros resultados hicieron posible la delimitación de un dominio funcional de la proteína Rep que incluye a la hélice-4 y que comprende residuos entre las posiciones 125 y 167 de esa proteína, el cual parece ser crítico para preservar su función en replicación. Adicionalmente, nuestros datos sugieren que los geminivirus tienen un potencial evolutivo similar al de los virus de RNA. Este fenómeno biológico de reversión rápida de mutaciones deletéreas tiene importantes implicaciones en las estrategias de control que se utilizan actualmente para combatir a los geminivirus."