Bases moleculares de la incompatibilidad replicativa de dos cepas de Rhynchosia mosaic Sinaloa virus

Abstract

"Los begomovirus tienen un genoma compuesto por una o dos moléculas circulares de DNA de cadena sencilla (ssDNA) de ~2.6 kb, que se replican por el mecanismo de círculo rodante (RCR) en el núcleo de la célula vegetal. La proteína iniciadora de la replicación (Rep) codificada por estos virus pertenece a la superfamilia de endonucleasas HUH, las cuales tienen un papel importante en la RCR de plásmidos, bacteriófagos, y virus circulares de ssDNA de organismos eucariotas, en la transferencia de plásmidos durante la conjugación bacteriana, y en distintos tipos de transposición. En el 2006 se aisló de una planta de Rhynchosia mínima colectada en Guasave, Sinaloa, una nueva especie de begomovirus que se denominó Rhynchosia mosaic Sinaloa virus (RhMSinV). En el presente trabajo aislamos tres begomovirus diferentes de una planta de R. minima colectada en Manzanillo, Colima, y su secuenciación reveló que uno de esos virus es una nueva cepa de RhMSinV (<92% de identidad). Este nuevo virus RhMSinV-CO exhibe en el origen de replicación cuatro presuntos sitios de unión de Rep (iterones) cuya secuencia (TGGAGTC). es diferente a la de los elementos homólogos del aislado original de Guasave (TGGAGGA), y a una variante de este último aislado también en este estudio, que denominamos RhMSinV-GUco. El alineamiento de las proteínas Rep codificadas por las dos cepas reveló una diferencia en el residuo amninoácido 71 (N-D), que fue identificado en trabajos previos de nuestro laboratorio como un potencial determinante de especificidad (SPD) de la proteína Rep. El modelado de la estructura tridimensional del dominio endonucleolítico de las proteínas Rep de RhMSinV-CO y -GU reveló que sus presuntos SPDs (los residuos 9, 11, 71 y 73) exponen sus grupos laterales hacia la superficie de una mini-hoja beta (β1-β5) que se considera crítica para el reconocimiento y unión de Rep a su DNA cognado. Experimentos de replicación transitoria en protoplastos, y de inoculación por biobalística de plantas de Nicotiana benthamiana, demostraron que RhMSinV-GU y RhMSinV-CO son incompatibles en replicación, como se predijo a partir de las diferencias en sus potenciales determinantes de especificidad (iterones y Rep-SPDs). En contraste, el DNA-A de la cepa RhMSinV-CO y el DNA-B de un begomovirus filogenéticamente distante, Pepper golden mosaic virus (PepGMV) que presenta iterones y Rep-SPDs similares, formaron pseudo-recombinantes viables que indujeron síntomas severos en las plantas bombardeadas."

"The begomoviruses have genomes composed by one or two circular molecules of single stranded DNA (ssDNA), ~2,6 kb in length, which are replicated by a rollingcircle (RC) mechanism in the nucleus of the plant cell. The replication initiation protein (Rep) encoded by the begomoviruses belongs to the HUH endonuclease superfamily, and is essential for the replication process. Those proteins play a key role in the RCR of plasmids and bacteriophages, in plasmid transfer, in the replication of several eukaryotic viruses, and in various types of transposition. In 2006 we isolated from a leguminous weed (Rhynchosia minima) collected in Guasave, Sinaloa, a new begomoviral species named Rhynchosia mosaic Sinaloa virus (RhMSinV). In this work three different begomoviruses were isolated from a single R. minima plant collected in Colima, and their sequencing revealed that two of those viruses are novel strains of RhMSinV (<92% identity). One of these exhibited four Rep-binding sites (iterons) similar to those of the original isolate (i.e., TGGAGGA), whereas the second strain displayed iterons with a TGGAGTC core sequence. Sequence alignments of the two Rep proteins showed a difference in the aa residue at position 71 (N/D), which is one of the five aa residues which were predicted to function as major determinants of geminivirus Rep DNA-binding specificity (SPDs). Modeling of the 3-D structure of the Rep endonuclease domain revealed that the putative SPDs (i.e. 9, 11, 71 y 73) point their side chains toward the exposed surface of the small beta-sheet (s1-s5) element, that is apparently critical for high-affinity DNA-binding of Rep proteins. Experiments of transient replication in protoplasts and plant inoculation by biobalistics revealed that RhMSinV-GU and RhMSinV-CO are incompatible in replication. In contrast, biolistic coinoculation of N. benthamiana plants with RhMSinV-CO DNA-A and the genomic component B of Pepper golden mosaic virus (PepGMV), a distant relative harboring similar replication specificity determinants, induced severe symptoms 15 dpi, thus demonstrating the formation of infectious pseudo-recombinants. Taken together, our data provide strong support to the hypothesis that specific amino acid residues sited at beta-strands 1 and 5 of the RhMSinV Rep protein are actually virus-specific replication determinants."