Obtención y caracterización de plantas productoras de antígenos relevantes de Escherichia coli enterotoxigénica

Abstract

"Las enfermedades diarreicas causada por Vibrio cholerae y Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) son problemas de impacto mundial que podrían ser prevenidas mediante vacunas comestibles, constituidas por plantas que produzcan la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) o de la toxina termolábil de ETEC (LTB). En este trabajo de tesis se produjo exitosamente LTB en zanahoria, la cual fue codificada por un gen sintético con codones optimizados. Para ello se estandarizó el protocolo de transformación de zanahoria mediado por Agrobacterium tumefaciens. Se obtuvieron nueve líneas transgénicas y se realizó un ensayo GM1-ELISA para determinar el contenido de LTB en las raíces de plantas adultas. Las líneas transgénicas expresaron LTB en niveles de hasta 0.3% de la proteína total soluble (PTS), lo cual representa niveles un orden de magnitud por arriba de los reportes que han usado el gen bacteriano. Este ensayo también confirmó el correcto ensamble del complejo pentamérico al ser reconocido por su ligando natural, GM1. Por otro lado, se analizó la respuesta inmune inducida en ratones Balb/c por la ingestión de las zanahorias transgénicas. Después de la administración oral de tres dosis semanales de raíces que contenían 10 μg de LTB recombinante, se detectaron niveles significativos de anticuerpos anti-LTB de clase G (IgG) y A (IgA) en suero e intestino. El análisis de subclases de IgG reveló que se trata de una respuesta predominantemente humoral. Además, cuando los ratones fueron retados por vía oral con toxina del cólera, que es altamente homóloga a la toxina termolábil de ETEC, se observó un decremento en la acumulación de fluido intestinal en los que fueron inmunizados con las plantas transgénicas. Estos resultados sugieren que las zanahorias transgénicas productoras de LTB podrían ser usadas como una vacuna comestible eficaz contra el cólera y la diarrea causada por ETEC en humanos. Por otro lado, se produjo en plantas de tabaco una proteína de fusión entre LTB y la toxina termoestable de ETEC (ST) con el objetivo de contar con un polipéptido que confiera mayor rango de protección contra las cepas de ETEC. Para ello, se construyó un gen sintético que codifica la fusión LTB-ST, el cual fue empleado para la transformación de tabaco mediante A. tumefaciens. Se obtuvieron ocho líneas transgénicas que fueron caracterizadas parcialmente. Los niveles de expresión máximos fueron de 0.5 ng/μg PTS (0.05% PTS). El ensayo GM1-ELISA confirmó la presencia de la estructura pentamérica de la proteína LTB -ST, así como la presencia de los determinantes antigénicos de LTB. La integridad de la proteína de fusión fue confirmada por un análisis tipo Western blot usando anticuerpos contra LTB. Estos resultados sugieren que la proteína de fusión LTB-ST es correctamente ensamblada y que podría ser útil en la inducción de respuestas inmunes de mucosas que resulten protectoras hacia ambas toxinas, las cuales constituyen factores de patogenicidad importantes en las infecciones por V. cholerae y ETEC."

"Diarrheal diseases caused by Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are worldwide health problems that might be prevented with vaccines based on edible plants expressing the B subunit of the cholera toxin (CTB) or the E. coli heat labile toxin (LTB). We have successfully expressed the LTB encoded by a synthetic codon-optimized gene in an edible crop, carrot. An efficient Agrobacterium-mediated transformation method was used for the transgene installation into carrot nuclear genome. Thirty independent kanamycin resistant transgenic lines were regenerated. GM1-ELISA assay was used to assess LTB protein content in mature tap roots. Transgenic lines expressed LTB up to 0.3% of the total soluble protein. Immunological assay also confirmed proper assembly of the pentameric complex. We analyzed the immunity induced in Balb/c mice by ingestion of three weekly doses of transgenic carrot material containing 10 μg of recombinant LTB. Anti-LTB immunoglobulin G (IgG) and IgA serum and intestinal antibody responses were elicited by transgenic carrots. A decrease of intestinal fluid accumulation after cholera toxin challenge was observed in mice immunized with either pure recombinant LTB or LTB-containing carrot material. These results suggest that transgenic carrots expressing LTB may be used as an effective edible vaccine against cholera and ETEC diarrhea in humans. In other hand, we successfully expressed a fusion protein between LTB and the heat stable toxin (ST), as a first step to produce an antigenic protein to induce immunity against both toxins; this approach would lead to an improved vaccine against ETEC. A genetic fusion for LTB and ST was constructed and cloned into pBI121 binary vector and used to generate transgenic tobacco plants via Agrobacterium-mediated transformation. Eight transgenic tobacco lines were regenerated and GM1-ELISA tests for protein extracts showed that LTBST fusion retains the LTB-pentameric structure and the levels of protein reached up to 0.5 ng/μg PTS (0.05% PTS). The integrity of the fusion protein was confirmed by Western blot analysis. These findings suggest that LTB-ST fusion protein is properly assembled in tobacco plants, and may be used as an effective and broader protective edible vaccine against cholera and ETEC diarrhea in humans."