Identificación y caracterización de genes de frijol (Phaseolus vulgaris L.) inducidos por estrés salino

Abstract

"The main goal of the present investigation was the isolation and identification of salt induced genes in a drought tolerant bean cultivar. The first step to achieve such objective was to conduct a comparative analysis in two bean cultivars, Pinto Villa and Canario 60, tolerant and sensitive to water stress respectively. Biochemical and physiological parameters like polyamine content, proline, chlorophyll, as well as leaf water potential (Ψw), were analyzed in order to characterize the response of both bean cutivars to NaCl treatment. The results demonstrated that the Pinto Villa cultivar has a major salt tolerance respect to Canario 60. Based on the above results we decided to continue the study with a Suppression Subtractive Hybridization (SSH) in the tolerant cultivar Pinto Villa under salt stress, from which 71 unigenes potentially induced by this condition were isolated. The identified genes were classified into 8 functional categories: genes related to stress (41 %), cell maintenance and development (22 %), transport (10 %), photosynthesis and chloroplast (7 %), transcriptional factors (6 %), signaling (4 %), photorespiration (4 %) and other (6 %). Eight of these genes isolated, the transcription factor ATHB-12, the heat shock protein DNAJ, the LEA-18, the E subunit of vacuolar ATPase, the dehydrin, the type 2 metallothionein, the Sadenosylmethionine-synthase and the aquaporin, were selected for expression assays by RT-PCR in both cultivars, the tolerant Pinto Villa, from which they were isolated, and the sensitive Canario 60 and thus confirmed their differential expression. The most induced genes in Pinto Villa were the factor ATHB-12 and those coding the vacuolar ATPase, LEA-18 and S-adenosylmethionine synthase proteins. In the bean SSH under salt stress, the unigene 31 corresponds to a cDNA fragment of the S-adenosylmethionine decarboxylase 1 (samdc1), which is a paralogous of the bean Pvsamdc2 reported previously by our group. Subsequently, we found the task of getting the open reading frame of the new samdc gene by using a forward primer designed on the unigene 31 (which includes part of the UTR-5' and 305 bases of the open reading frame) and a reverse primer at the end of the open reading frame of the gene Pvsamdc2. In this way we amplified a 1230 bases long cDNA fragment of the Pvsamdc1 gene, which was registered with the GenBank access number EF580132."

"El objetivo principal de esta investigación fue aislar e identificar genes inducidos por estrés salino en una variedad de frijol reportada como tolerante a estrés hídrico. Por lo tanto los pasos preliminares para alcanzar dicho objetivo fueron llevar a cabo un análisis comparativo entre la variedad Pinto Villa, tolerante a sequía, y la variedad Canario 60, sensible a sequía. Para iniciar este estudio, se analizaron parámetros bioquímicos y fisiológicos como el contenido de poliaminas, prolina, clorofila, así como el potencial hídrico de las hojas (Ψw) para caracterizar la respuesta de estas variedades de frijol bajo el tratamiento con NaCl; obteniendo que la variedad Pinto Villa fue la más tolerante a estrés salino en comparación con la variedad Canario 60. En base a los resultados anteriores se decidió continuar el estudio construyendo una biblioteca sustractiva en la variedad tolerante de frijol Pinto Villa bajo estrés salino, a partir de la cual se identificaron 71 unigenes potencialmente inducidos bajo esta condición. Los genes identificados fueron clasificados en 8 categorías funcionales: genes relacionados a estrés (41 %), mantenimiento celular y desarrollo (22 %), transporte (10 %), fotosíntesis y cloroplasto (7 %), factores transcripcionales (6 %), señalización (4 %), fotorespiración (4 %) y otros (6 %). La expresión de ocho de estos genes aislados en la biblioteca sustractiva: el factor transcripcional ATHB-12, una proteína DNAJ de choque térmico, una LEA-18, la subunidad E de una ATPasa vacuolar, una dehidrina, una metalotioneina tipo 2, una S-adenosilmetionina sintasa y una acuaporina, fue analizada mediante ensayos de RT-PCR semicuantitativa tanto en la variedad tolerante de frijol Pinto Villa, a partir de la cual fueron aislados, como en la variedad sensible Canario 60, y de esta manera se confirmó su expresión diferencial. Los genes más sobreexpresados en Pinto Villa fueron el factor ATHB-12 y los que codifican a las proteínas ATPasa vacuolar, LEA-18 y S-denosilmetionina sintasa. En la biblioteca sustractiva de frijol bajo estrés salino, el unigen 31 corresponde a un fragmento de cDNA del gen S-adenosilmetionina descarboxilasa 1 (samdc1), el cual es parálogo al gen Pvsamdc2 de frijol descrito anteriormente por nuestro grupo de investigación. Posteriormente, nos dimos a la tarea de obtener el marco de lectura abierto del nuevo gen de samdc, utilizando oligonucleótidos diseñados en el unigen 31 (que incluye parte del UTR-5´ y 305 nt del marco de lectura abierta) y un oligonucleótido diseñado al final del marco de lectura abierta del gen Pvsamdc2. De esta manera, logramos aislar 1230 nt del cDNA del gen Pvsamdc1 con número de acceso GenBank EF580132. Dicho gen (Pvsamdc1), junto a otros genes de la biosíntesis de poliaminas (Pvadc, Pvsamdc2, Pvspds), aislados previamente por nuestro grupo, fueron analizados transcripcionalmente bajo estrés salino así como con otros tratamientos tales como frío, ácido abscísico y poliaminas exógenas. Con este experimento se pudo observar que la variedad Pinto Villa responde más activamente a la adición exógena de poliaminas respecto a Canario 60, y además que Pvadc, Pvsamdc1, Pvsamdc2 y Pvspds son genes que responden a ácido abscísico en las condiciones analizadas en el cultivar tolerante Pinto Villa."