Construcción de secuencias en tándem para análisis de interacción proteína-ADN en herramientas de molécula única

Abstract

"La interacción proteína-ADN tiene un rol determinante en diversos mecanismos biológicos, como son la regulación de la transcripción de genes, la replicación y recombinación sitio específica. Entre las proteínas que llevan a cabo esta función, destacan los factores de transcripción. La gran mayoría de los estudios realizados de la interacción proteína-ADN se han llevado a cabo con estrategias tradicionales, las cuales llegan a enmascarar el comportamiento de moléculas que representen un porcentaje pequeño dentro la muestra. En años recientes, el empleo de herramientas de molécula única, como son la microscopia de fuerza atómica y las pinzas ópticas, ha facilitado el estudio de estas moléculas debido al uso de partículas individuales. El presente trabajo se enfoca en estudiar las proteínas CAP, Clp y SdrP, que pertenecen a la familia CRP/FNR, ampliamente distribuida en bacterias. Estos factores de transcripción tienen la capacidad de interaccionar con los mismos sitios de unión, el sitio de unión nativo del promotor de lactosa (LacNat) y un sitio consenso (CONCAP). Los tres objetivos principales que nos planteamos fueron los siguientes. El diseño y construcción de secuencias repetidas en tándem que contenga los sitios de unión LacNat y CONCAP, para su uso en trabajos posteriores de molécula única. Evaluar la interacción de CAP y SdrP con las secuencias construidas LacNat y CONCAP de un solo repetido, mediante EMSA y DLS. Finalmente, un análisis bioinformático para determinar secuencias ortólogas de Clp con características más favorables para su expresión y purificación. Los resultados constan de la obtención de las construcciones en tándem con dos y tres copias para la secuencia CONCAP y LacNat, respectivamente. La purificación de las proteínas CAP y SdrP, con un rendimiento final de 26 mg y 20 mg por litro de cultivo, respectivamente, y una pureza superior al 90%. Así mismo, los análisis de interacción preliminares indican que CAP y SdrP son capaces de interaccionar con las secuencias CONCAP y LacNat, con un solo repetido. La constante de disociación (Kd) preliminar de SdrP por la secuencia CONCAP fue 0.23 nM y de 0.74 nM para LacNat, ambas estimadas por EMSA. Por último, se seleccionaron 10 ortólogos putativos cuya predicción de éxito en procesos de expresión y purificación fue más favorable, comparada con la secuencia de Xanthomonas campestris que ha sido cristalizada."

"The protein-DNA interaction has a determining role in various biological mechanisms, such as the regulation of gene transcription, replication and site-specific recombination. Among the proteins that perform this function, the transcription factors stand out. In bacteria the family of CRP / FNR transcription factors is one of the most widely distributed. Because of the differences in their interaction mechanisms and their structural similarity, we are interested in three members of this family, CAP, Clp and SdrP. These proteins have the ability to interact with the same binding sites, the native lactose promoter binding site (LacNat) and a consensus site designed in the 1980s (CONCAP). The vast majority of studies of the protein-ADN interaction have been carried out with traditional strategies, which come to hide the behavior of molecules representing a small percentage within the sample. In recent years, the use of single-molecule tools, such as atomic force microscopy and optical tweezers, has facilitated the study of these molecules due to the use of individual particles. The three main objectives we proposed were as follows. The design and construction of repeated sequences in tandem containing the LacNat and CONCAP binding sites, for use in subsequent single molecule works. To evaluate the interaction of CAP and SdrP with the sequences constructed LacNat and CONCAP of a single repeated, by EMSA and DLS. Finally, a bioinformatic analysis to determine orthologous sequences of Clp with characteristics more favorable for its expression and purification. Our results show that the tandem integration of two and three copies of CONCAP and LacNat sequences, respectively, were successfully cloned in pBlueScript vector. We obtained protein concentrations of 26 mg and 20 mg per liter of culture for CAP and SdrP, respectively, and a purity greater than 90% for both proteins. Also, preliminary interaction analyzes indicate that CAP and SdrP are capable of interacting with the CONCAP and LacNat sequences when exposed to an individual copy of the binding site. A preliminary dissociation constant (Kd) of of 0.23 nM for CONCAP and 0.74 nM for LacNat was determinated for SdrP transcription factor, estimated by EMSA. Finally, 10 putative orthologues were selected whose prediction of success in expression and purification processes was more favorable."