Análisis funcional del gen PBC1 involucrado en la defensa contra el cáncer bacteriano en tomates silvestres mediante VIGS y CRISPR/Cas 9

Abstract

" El tomate (Solanum lycopersicum) es uno de los productos hortícolas más importantes a nivel mundial, con una producción anual valorada en $88 miles de millones de dólares. México ocupa el 10mo lugar de los mayores productores a nivel mundial, sin embargo, su producción se ha visto mermada por organismos fitopatógenos, siendo la bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) una de los responsables de mayores pérdidas en la producción. Las estrategias de control de Cmm no son efectivas una vez que la enfermedad es detectada, sin embargo, se sabe que especies silvestres como Solanum peruvianum acc. 2172 y Solanum arcanum acc. 2157, presentan resistencia natural a Cmm. Existen reportes de un análisis transcripcional diferencial en plantas resistentes a Cmm al comparar plantas no infectadas y después de infectar, donde se detectaron genes sobreexpresados posterior a la infección, entre ellos el gen de la subunidad beta del proteasoma tipo 3 (PBC1), y con base en esto se decidió hacer un análisis funcional de PBC1, mediante Silenciamiento Génico Inducido por Virus (VIGS) y con el sistema CRISPR/Cas9. El objetivo de este trabajo fue determinar si el gen juega un papel importante en la defensa de la planta contra Cmm. El análisis funcional del gen PBC1 por VIGS se realizó en plantas silvestres: Solanum peruvianum 2172 y Solanum arcanum 2157, utilizado el vector del Virus Moteado del Tomate (ToMoV) y por métodos de biobalística. Después de la infección con Cmm se realizó una comparación del fenotipo de las plantas sanas sin infectar con plantas enfermas. Además de evaluó la carga bacteriana y la expresión del gen PBC1 mediante qRT-PCR. Para el knock out de PBC1 se utilizó el sistema CRISPR/Cas 9. El diseño de las secuencias guías se realizó con dos estrategias, 1) utilizando una secuencia ARN guía y 2) utilizando un sistema multiplex que contiene tres guías individuales. En plantas silvestres S. peruvianum 2172, con silenciamiento de PBC1 mediante VIGS, la expresión del gen disminuyó ~80%, y la carga bacteriana de Cmm incrementó, demostrando susceptibilidad a Cmm comparado con plantas sin silenciamiento. Esto sugiere que PBC1 puede estar involucrado en la resistencia de plantas silvestres contra Cmm y pudiera usarse como un elemento central de una estrategia para generar tomates resistentes. Sin embargo, en S. arcanum 2157 la carga bacteriana no mostró un cambio considerable comparada con el control, además de que en algunas plantas no hubo cambio en la expresión de PBC1 a pesar del silenciamiento con VIGS tal vez debido a complicaciones técnicas de biobalística o asociadas a algunas características de la especie en particular. "

"The tomato (Solanum lycopersicum) is one of the most important crops in the world, valued at $88 billion USD annually. Mexico is the 10 th largest producer globally, however its production has been diminished due to pathogens among which stands out Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) that is responsible of great losses. The control strategies against this bacterium are not effectives once the disease is detected; however it is known that some wild species such as Solanum peruvianum acc. 2172 and Solanum arcanum acc. 2157 are resistant to Cmm. Some works on tomato wild species resistant to Cmm showed differential expressed genes when uninfected and Cmm infected plants were compared. Some genes were overexpressed after the challenge, among these, the proteasome beta subunit type 3 (PBC1), based on this, we decided to perform a functional analysis of PBC1, through Virus Induced Gene Silencing (VIGS) and CRISPR/Cas9 system. The aim of this work was assessing the role of that gene in plant defense against Cmm. Functional analysis of PBC1 with VIGS was performed in the wild tomato species Solanum peruvianum acc. 2172 and Solanum arcanum acc. 2157 using the Tomato Mottle Virus (ToMoV) vector and delivery was done by biolistic methods. After inoculation with Cmm the phenotype of the healthy and infected plants was compared and correlated to bacterial load and qRT-PCR of PBC1. Knockout of the PBC1 gene was accomplished with the CRISPR/Cas 9 system. Guides specific to the PBC1 gene were designed with two strategies, 1) using single RNA guides and 2) using a multiplex system containing three individual guides. In plants S. peruvianum 2172 silenced by VIGS, PBC1 expression decreased ~80% in some plants and, the Cmm bacterial titer increased, demonstrating an increase in Cmm susceptibility on plants compared with the wild species without silencing. This observation suggests that PBC1 could be involved in resistance against Cmm in wild species and overexpression approaches could help with engineering or breeding for resistance in commercial tomatoes. Nevertheless, in S. arcanum 2157 the bacterial titer was not significantly different in comparison to the control and in some plants the gene expression of PBC1 was unchanged despite VIGS, perhaps due to biolistic technical complications or because of particular characteristics of this plant species."