Polimorfismos de los genes CYP2C9, CYP2D6, G6PD y GCLC involucrados en el metabolismo de sulfametoxazol y ciprofloxacino: identificación basada en la secuenciación

Abstract

"CONTEXTO. Sulfametoxazol (SMX) y ciprofloxacino (CPFX), dos de los antimicrobianos más prescritos, tienen efectos adversos en personas con idiosincrasias genéticas. Algunos polimorfismos de nucleótido único (SNPs) de los genes que codifican la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la subunidad catalítica de la ligasa de glutatión-cisteína (GCLC) aumentan el riesgo de anemia hemolítica. Ciertos SNPs de GCLC y del gen que codifica la citocromo oxidasa 2C9 (CYP2C9) aumentan el riesgo de hipersensibilidad a SMX y ciertos SNPs de CYP2D6 están asociados a reacciones adversas cuando CPFX es coadministrado con otros medicamentos. En México hay algunos estudios sobre la frecuencia de algunas variantes alélicas de CYP2C9, CYP2D6 y G6PD pero no del gen GCLC. OBJETIVOS. Nos propusimos desarrollar un método de bajo costo basado en el análisis de la secuencia nucleotídica para identificar polimorfismos clínicamente relevantes de los genes CYP2C9, CYP2D6, G6PD y GCLC involucrados en el metabolismo de SMX y CPFX y en las reacciones adversas a estos antimicrobianos. MÉTODOS. Diseñamos y validamos in silico las parejas de oligonucleótidos iniciadores para generar seis productos de amplificación (‘amplicones’) que contengan SNPs clínicamente relevantes de los genes de interés. Optimizamos las condiciones de PCR para generar amplicones puros. Produjimos amplicones puros en mezclas de PCR optimizadas a partir del DNA de los 100 sujetos que fueron incluidos en el estudio y los aislamos por precipitación. Secuenciamos los amplicones, identificamos los SNPs y determinamos la frecuencia de las variantes alélicas, los fenotipos respectivos, el equilibrio de Hardy-Weinberg, así como identificar los haplotipos y su desequilibrio de ligamiento. RESULTADOS. Las secuencias de los amplicones coincidieron con las de los genes de referencia. Frecuencias de las variantes alélicas identificadas, de CYP2C9: *2, 18%; *3, 6%; *26, 1%; *44, 1%; *45, 1%; *55, 2%; de CYP2D6: rs1135824, 89%; *4, 3%; *6B, 1%; *50, 3%; *90, 2%; de GCLC: rs761142, 87%; de G6PD-Canton: 19% en mujeres en estado heterocigótico, 14% en hombres en estado hemicigótico; de G6PD-Mediterranean: 0%. Frecuencias de los fenotipos predichos: CYP2C9: normal 75%, intermedio 22%, pobre 3%; CYP2D6: rápido 11%, intermedio 2%, pobre 6%, indeterminado 81%. Fenotipo CYP2C9 normal concomitante con GCLC intermedio y pobre: 40% y 23%, respectivamente. Fenotipo G6PD normal/GCLC intermedio en 8% de los hombres; fenotipo G6PD normal/GCLC pobre en 2% de los hombres; fenotipo G6PD intermedio/GCLC intermedio en 16% de las mujeres; fenotipo G6PD intermedio/GCLC pobre en 3% de las mujeres. De los cuatro haplotipos identificados solamente CYP2D6 T1707ΔT/G1976A estuvo en completo desequilibrio de ligamiento. CONCLUSIONES. Identificamos por primera vez nueve variantes alélicas en una población mexicana: CYP2C9 *26, *44, *45, *55; CYP2D6 rs1135824, *6B, *50, *90 y GCLC rs761142. Entre los sujetos incluidos en el estudio el riesgo de anemia hemolítica por SMX es alto en el 29% (19% de las mujeres, 10% de los hombres) que porta las variantes G6PD-Canton y GCLC rs761142; en contraste, el riesgo de anemia hemolítica por CPFX parece ser nulo por ausencia de la variante G6PD-Mediterranean. El 63% de los sujetos con fenotipo concomitante CYP2C9 normal/ GCLC pobre o intermedio, tendría riesgo máximo de hipersensibilidad a SMX. El riesgo de efectos adversos por CPFX es desconocido porque, aunque la mayoría (81%) porta la variante CYP2D6 rs1135824, la funcionalidad de la enzima no ha sido determinada."

"BACKGROUND. Sulfamethoxazole (SMX) and ciprofloxacin (CPFX), two of the most prescribed antimicrobials, cause adverse effects in people with genetic idiosyncrasies. Certain single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the genes encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and the glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) increase the risk of hemolytic anemia. Several SNPs of the GCLC and the cytochrome oxidase 2C9 (CYP2C9) genes increase the risk of hypersensitivity to SMX. Some CYP2D6 SNPs are associated with adverse reactions when CPFX is co-administered with other drugs. In Mexico there are scarce population studies of CYP2C9, CYP2D6 and G6PD allelic variants and none on GCLC. AIMS. In this work we developed a low cost reliable method based on nucleotide sequence analysis to identify clinically relevant SNPs from the CYP2C9, CYP2D6, G6PD and GCLC genes involved in SMX and CPFX metabolism and adverse reactions. METHODS. Primer oligonucleotide pairs were designed and validated in silico to generate six amplification products (‘amplicons’) containing known clinically relevant SNPs of the genes of interest, and PCR conditions were optimized to generate pure amplicons from template DNA of 100 San Luis Potosí city residents. Amplicons were sequenced, SNPs were identified and used to determine allelic variant frequencies and the corresponding genotypes, phenotypes, Hardy-Weinberg equilibrium as well as to identify the haplotypes and their linkage disequilibrium. RESULTS. Identity of all amplicon sequences matched those of the reference genes. Frequencies of the allelic variants identified: CYP2C9 *2, 18%; *3, 6%; *26, 1%; *44, 1%; *45, 1%; *55, 2%; CYP2D6 rs1135824, 89%; *4, 3%; *6B, 1%; *50, 3%; *90, 2%; GCLC rs761142, 87%; G6PD-Canton, 19% heterozygous women; 14% hemizygous men; G6PD-Mediterranean, 0%; G6PD-Canton/GCLC rs761142, 19% in women, 10% in men. Phenotype frequencies: CYP2C9 normal 75%, intermediate 22% and poor 3%; CYP2D6 rapid 11%, intermediate 2% poor 6% and undetermined 81%. Normal CYP2C9 phenotype concomitant with intermediate or poor GCLC phenotype: 40% and 23%, respectively. Normal G6PD phenotype concomitant with intermediate GCLC phenotype, 8% in men; intermediate G6PD phenotype concomitant with GCLC poor phenotype, 2% in men; intermediate G6PD phenotype concomitant with intermediate GCLC phenotype, 16% in women; intermediate G6PD phenotype concomitant with poor GCLC phenotype, 3% in women. Among the four haplotypes identified only CYP2D6 T1707ΔT/G1976A was in complete linkage disequilibrium. CONCLUSIONS. We identified for the first time the following nine allelic variants in a Mexican population: CYP2C9 *26, *44, *45, *55; CYP2D6 rs1135824, *6B, *50, *90 and GCLC rs761142. Risk of hemolytic anemia by SMX is high in the subjects included since 29% of them (19% of the women, 10% of the men) carry the G6PD-Canton and GCLC rs761142 variants; in contrast, risk of hemolytic anemia by CPFX appears to be null since the G6PD-Mediterranean variant is absent. Nearly two thirds (63%) of the subjects included have normal CYP2C9 phenotype concomitant with poor or intermediate GCLC phenotype and would be at maximum risk of SMX hypersensitivity. Although the majority (81%) carry the CYP2D6 rs1135824 variant the risk of adverse effects by CPFX is unknown since activity of the corresponding enzyme has not been determined."