Caracterización molecular y funcional de genes que codifican proteínas de choque térmico (OpsHSP18, AtDjA2 y AtDjA3) de plantas bajo estrés abiótico

Abstract

"El estrés abiótico es la principal causa de pérdidas de cultivos en el mundo. Sin embargo, las plantas han desarrollado mecanismos que les permiten detectar, responder y tolerar a múltiples estreses. Uno de los principales mecanismos de tolerancia al estrés en plantas, es la síntesis de proteínas de choque térmico (HSP). En este trabajo se llevó a cabo la caracterización funcional del gen OpsHSP18 de nopal (Opuntia streptacantha) que codifica una HSP de bajo peso molecular (sHSP), el cual se aisló de una biblioteca de cDNA de nopal. Líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen OpsHSP18 mostraron un mayor porcentaje de germinación bajo estrés salino (NaCl) y osmótico (glucosa y manitol) y bajo la aplicación de ABA, en comparación con la WT (Col-0). Asimismo, en ensayos de tolerancia al estrés por la aplicación de NaCl o glucosa, las líneas 35S::OpsHSP18, mostraron un aumento en el porcentaje de supervivencia con respecto a Col-0. Por otro lado, en esta tesis nos enfocamos a estudiar los genes AtDjA2 y AtDjA3 de Arabidopsis que codifican para proteínas J (HSP40). Para su caracterización se obtuvieron líneas mutantes de T-DNA y se generaron líneas sobreexpresantes para ambos genes. Respecto al gen AtDjA3, se han reportado dos transcritos: el AtDjA3.1 (343 aa) y AtDjA3.2 (420 aa). La línea mutante del gen AtDjA3 mostró un fenotipo de sensibilidad a estrés salino, osmótico y tratamientos de ABA, mientras que las líneas que sobreexpresan la versión AtDjA3.2, mostraron una mayor tasa de germinación, mayor desarrollo de los cotiledones y peso fresco de las plántulas sometidas a estrés. También generamos líneas sobreexpresantes de la versión AtDJA3.1 de Arabidopsis, para su posterior análisis. En lo que respecta al gen AtDjA2, la línea mutante (j2) mostró un retraso en la germinación bajo los tratamientos de glucosa y ABA, caso contrario a lo observado en las líneas transgénicas. Este comportamiento fue también observado en el desarrollo de los cotiledones bajo la aplicación de NaCl y glucosa. Por último, con la finalidad de identificar proteínas blanco y/o interactores de las proteínas HSP, se construyeron vectores anzuelo para levadura pDHB1/OpsHSP18 y pDHB1/AtDJA2, que se utilizarán en el sistema de dos híbridos “Split ubiquitin”. Los resultados indican que ambas chaperonas de la familia HSP están involucradas en la respuesta al estrés abiótico, y una posible relación de las proteínas HSP con la ruta de señalización de ABA."

"Abiotic stress is the main cause of crop loss worldwide. However, plants have developed mechanisms that allow them to detect, respond to and tolerate multiple stresses. It has been reported that in plants the synthesis of heat shock proteins (HSP) is one of the main mechanisms of stress tolerance. In this work was performed the functional characterization of OpsHSP18 gene of cactus (Opuntia streptacantha) encoding a low molecular weight HSP (sHSP). This gene was isolated from a cactus cDNA library under abiotic stress. A. thaliana 35S::OpsHSP18 over-expressing lines showed a higher germination percentage under ABA application, salt (NaCl), and osmotic (glucose and mannitol) stress, compared to the WT (Col-0). Also, wasobserved an increase in the survival rate of over-expressing plants during the application of NaCl and glucose. Moreover, from a subtractive library (SHS) of bean (Phaseolus vulgaris) under salt stress it was isolated the unigen SSHPv-S38, which encodes the protein J (HSP40). In order to characterize the AtDjA3 and AtDjA2 orthologous genes from A. thaliana, we obtained over-expressing and T-DNA lines of these genes. It is known that AtDjA3 gene produce two transcript: AtDjA3.1 (343 aa) and AtDjA3.2 (420 aa). It was observed a sensitive phenotype during abiotic stress in mutant plants of the AtDjA3 gene in compared to Col-0. The 35S::AtDjA3.2 overexpressing lines showed a tolerance under salt and osmotic stress, and ABA application. The tolerance phenotype was measured by the increase of germination percentage, cotyledons development and fresh weight of seedlings. To date, we have over-expressing lines of the version AtDjA3.1 from Arabidopsis, this line will be analyzed under abiotic stress. Regarding AtDjA2 gene, it was observed a delay in germination percentage under glucose or ABA application in the mutant line of the AtDjA2 gene, whereas, an increase in germination percentage was observed in transgenic lines. Additionally, in the 35S::AtDjA2 transgenic lines, a higher percentage of green cotyledons development was observed under application of NaCl and glucose. In order to identify possible interactors of HSP proteins, we generate bait vectors pDHB1/AtDJA2 and pDHB1/OpsHSP18, for the "Split ubiquitin" two-hybrid system in Saccharomyces cerevisiae. From the results obtained during this study, both molecular chaperones of the HSP family are involved in the response abiotic stress; and hormone ABA."