Diagnóstico molecular de la tuberculosis bovina

Abstract

"CONTEXTO. El diagnóstico de la tuberculosis (TB) humana habitualmente no incluye la diferenciación de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), aunque la enfermedad causada por Mycobacterium bovis es una enfermedad del ganado bovino con prevalencia variable en humanos. En México la TB bovina causa pérdidas por alrededor de 450 millones de dólares anuales y es una fuente significativa de infección para los humanos. En San Luis Potosí nuestro grupo encontró recientemente que al menos 2.1% de los casos de TB pulmonar humana se deben a M. bovis. El propósito de este trabajo fue desarrollar un método de PCR multiplex anidada rápido y ultrasensible —consistente en dos mezclas multiplex directas (PCRM-D1 y PCRM-D2) y las mezclas de reacción multiplex anidadas correspondientes (PCRM-A1 y PCRM-A2— para identificar M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG, basado en el método de Pinsky y Banaei (J Clin Microbiol 46:2241-6, 2008), que consta de dos mezclas de reacción sucesivas, denominadas respectivamente Rx1 y Rx2, equivalentes a las mezclas “directas” del nuevo método que nos propusimos desarrollar. MÉTODOS. Diseñamos siete oligonucleótidos adicionales a los del método original para generar dos amplicones directos, dos semianidados “largos” y un amplicón semianidado corto, los cuales fueron probados en mezclas de PCR multiplex con DNA de tres cepas de referencia: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis AN5 o M. bovis BCG. Luego “preamplificamos” las mezclas PCRM-D1 y -D2 por 15 ciclos y usamos 1/25 de volumen como molde en las mezclas PCRM-A1 y -A2 que también amplificamos por 30 ciclos. Comparamos la sensibilidad de las mezclas PCRM-A1 “directa” (A1d) y anidada (A1a) empleando cantidades decrecientes de DNA de M. tuberculosis H37Rv en: 1) mezclas A1d que fueron amplificadas por 30 ciclos y 2) mezclas PCRM-D1 preamplificadas por 15 ciclos de la cuales aplicamos 1/25 de volumen a mezclas A1a que fueron amplificadas a su vez por 30 ciclos. RESULTADOS. En las mezclas PCRMD1 obtuvimos las bandas esperadas para M. tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG y M. bovis AN5. Observamos las dos bandas esperadas para M. tuberculosis con todas las diluciones de oligonucleótidos probadas. En las mezclas PCRM-A1 y -A2 preamplificadas obtuvimos todos los productos esperados e identificamos los amplicones específicos de M. tuberculosis, M. bovis y M. bovis BCG."

"BACKGROUND. The diagnosis of human tuberculosis (TB) usually does not differentiate the Mycobacterium tuberculosis complex species (MTC) although human TB caused by Mycobacterium bovis is a disease of cattle with varying prevalence in humans. In Mexico bovine TB is a significant source of infection for humans and causes losses of 450 million dollars annually. Our group recently found that in San Luis Potosí at least 2.1% of the human pulmonary TB cases are caused by M. bovis. The purpose of this work was to develop a fast and ultrasensitive nested multiplex PCR method —consisting of two direct multiplex reactions mixtures (PCRM-D1 and PCRM-D2) and the corresponding nested multiplex reaction mixtures (PCRM-A1 and PCRM-A2)— to identify M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG, based on the method Pinsky and Banaei (J Clin Microbiol 46:2241-6, 2008) comprising two successive reaction mixtures called Rx1 and Rx2, equivalent to the “direct” mixtures of the new method. METHODS. Seven oligonucleotides additional to those of the original method were designed to generate two direct, two seminested “long” amplicons and one seminested “short” amplicon which were tested in multiplex PCR mixtures with DNA from three reference strains: M. tuberculosis H37Rv, M. bovis AN5 or M. bovis BCG. PCRM-D1 and -D2 mixtures were then “preamplified” for 15 cycles and 1/25 volume was used as template in PCRM-A1 and -A2 mixtures that were also amplified for 30 cycles. The sensitivity of “direct” PCRM-A1 (A1d) and nested (A1a) was compared using decreasing amounts of M. tuberculosis H37Rv in DNA as templates in: 1) A1d mixtures amplified for 30 cycles, 2) PCRM-D1 mixes “preamplified” for 15 cycles from which 1/25 volume was applied to A1a mixtures that were in turn amplified for 30 cycles. RESULTS. PCRM-D1 mixtures generated all bands expected for M. tuberculosis H37Rv, M. bovis BCG and M. bovis AN5. The two bands expected for M. tuberculosis were generated with all the oligonucleotide dilutions tested. In “preamplified” PCRM-A1 and -A2 mixtures all the products expected were obtained and the M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG specific amplicons were identified. In PCRM-A1d mixtures the expected bands were obtained with 353 fg of M. tuberculosis H37Rv DNA (equivalent to 74 genome copies) and in PCRM-A1a with 7 fg (equivalent to 1 genome copy)."