Effect of operational parameters on methanol biofiltration coupled with Endochitinase 42 production

Abstract

"En la presente tesis se estudió la biofiltración de metanol acoplada con la producción de proteínas heterólogas. Para ello, se utilizó un cultivo de P. pastoris transformado con el gen Ech42 responsable de producir la Endoquitinasa 42 de Trichoderma Atroviride (Pérez-Martínez et al., 2007). Se diseñaron tres biofiltros idénticos y se operaron bajo diferentes condiciones de carga de metanol, concentración de nitrógeno, pH y tiempo de residencia. La máxima capacidad de eliminación de metanol observada fue de 643.5 g/m3*h a una carga de metanol de 800 g/m3*h, 5 g/L (NH4)2SO4, pH 5 y 60 segundos de tiempo de residencia. La actividad de Ech42 varió entre 578 y 1172 U/L siendo el pH el parámetro más importante para el proceso. Además, se encontró que la capacidad de eliminación del sistema fue muy sensible a los cambios de condiciones manejadas. Sin embargo, la actividad de la proteína heteróloga fue notablemente estable. Por otro lado, también se estudió la divergencia del sistema a través de un análisis estadístico simple, microscopía electrónica de barrido y análisis cinético, durante las primeras tres etapas de operación. Se observó que dos o más sistemas de biofiltración pueden comportarse de distinta manera con el tiempo, aún y cuando son operados bajo las mismas condiciones. Algunas explicaciones probables son los procesos aleatorios de colonización de otras especias así como la impredecible evolución de comunidades microbianas. En cualquier caso, los resultados mostrados en esta tesis son el primer reporte de divergencia en biofiltros. Finalmente, se desarrolló un modelo matemático dinámico para describir el desempeño de los sistemas de biofiltración acoplados a la producción de proteínas. Éste se basó en ecuaciones para reactores CSTR (Completely Stirred Tank Reactor) pero en una estructura discretizada del sistema. Para la degradación de metanol se utilizó el modelo de Monod. Se consideró la presencia de dos grupos de microorganismos creciendo en los sistemas: P. pastoris y otros microorganismos. El modelo mostró un buen ajuste en relación con las capacidades de eliminación experimentales y la producción proteica. Sin embargo, fue difícil ajustar los valores experimentales de biomasa total presente (volumen). Tal discrepancia puede deberse a que el modelo no considera biomasa inerte. Por lo anterior, es recomendable que el modelo matemático sea modificado o replanteado."

"In this thesis, methanol biofiltration coupled with heterologous protein production was studied. A P. pastoris strain transformed with the gen Ech42 responsible for producing Endochitinase 42 (Ech42) was used (Pérez-Martínez et al., 2007). Three different biofilters were designed and tested under different methanol loads, nitrogen concentrations, pH and EBRT (Empty Bed Residence Time) conditions. The maximum elimination capacity observed was 643.5 g/m3*h under a methanol load of 800 g/m3*h, 5 g/L (NH4)2SO4, pH 5 and 60 seconds of EBRT. Also, the Ech42 activity ranged from 578 to 1172 U/L and was mainly affected by pH changes. Additionally, it was observed that EC was very sensitive to changes under the mentioned operational conditions. However, the heterologous protein activity was quite stable. On the other hand, divergence in the system was approached. It was noted that two or more systems operating under identical conditions can behave differently over time. Thus, repeatability in biofiltration shouldn’t be taken for granted. Some probable explanations for such divergence are the random colonization of foreign species as well as the unpredictable evolution of microbial communities. In any case, this is the first report of operational divergence in biofilters. Finally, a dynamic mathematical model was developed based on CSTR equations. A Monod kinetic was used in order to describe methanol consumption behavior. Also, microbial growth was considered for two different kinds of microorganisms: P. pastoris and others. The model fit well with experimental elimination capacities and protein production. However, total biomass volume was not well described. The source of the model discrepancy could be the failure to consider inert biomass. Therefore, the mathematical model must be further explored."