Optimización de métodos de análisis molecular in situ para su aplicación en hojas de plantas

Abstract

"La Reacción en Cadena de la Polimerasa de Transcripción Inversa in situ (IS-RT-PCR por sus siglas en inglés) permite conocer la ubicación espacial de RNAm en un tejido. El Mapeo por Espectrometría de Masas con Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz (MALDI-MSI por sus siglas en inglés), permite conocer la ubicación espacial en un tejido, de una gran cantidad de analitos como: proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y metabolitos. Ambas técnicas son relativamente recientes y requieren de un laborioso proceso para ejecutar un análisis. Sin embargo, la cantidad de información que pueden proveer justifica el tiempo requerido. Los protocolos de preparación de muestras publicados para estos análisis tienen puntos susceptibles de mejora que harían más fácil o mejor la ejecución. En el presente trabajó se indagó en estos protocolos y se y se mejoraron algunos pasos. El principal inconveniente con el protocolo de IS-RT-PCR es la dificultad de manipular un corte histológico en laminilla. Así, en el presente trabajo se investigó la posibilidad de ejecutar el análisis en un fragmento de hoja que se conserve de epidermis a epidermis. Se logró una reacción parcial en este fragmento. En MALDI-MSI el principal punto de mejora fue mantener la integridad del corte al secarlo estando en un medio de inclusión, así como aplicar de manera homogénea la matriz. El mejor medio de inclusión fue carboximetilcelulosa al 2% en sacarosa al 9.25%. Para la aplicación de la matriz, se utilizó la impresora EPSON T50 y se encontró que el cabezal negro es capaz de despachar gotas de hasta 35 µm de diámetro de manera muy precisa. Con este resultado concluimos que el uso de la impresora T50 es adecuado y económico. En el segundo capítulo, nos enfocamos a caracterizar los cristales de oxalato de calcio presentes en hojas de amaranto."

"In situ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (IS-RT-PCR), allows to know spatial location of mRNA in a tissue. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) permits to know spatial publication in a tissue of a variety of analytes as: proteins, lipids, carbohydrates, nuclei acids and metabolites. Both techniques are relative recent and require a laborious process to perform one analysis. Nevertheless, the amount of information that can be obtained justifies the time required for it. Published protocols of sample preparation for these analyses have steps that can be improved in order to be easier or better performing. In this work we inquired these protocols and improve some steps. The main inconvenient with the IS-RT-PCR protocol is the difficulty of handling a histological cut on a glass slide. So in this work we investigated the performing of protocol in a leaf fragment that is preserved from epidermis to epidermis. We achieve a partial reaction in the leaf fragment. In MALDI-MSI the main improving points were keeping cut integrity while it is dried in an embedding media, and applying matrix solution in a homogenous manner. The best embedding media was 2% carboxymethylcellulose in 9.25% sucrose. For matrix application, we used an EPSON T50 inkjet printer, we found that black nozzle can dispatch drops of until 35 µm of diameter in a very precise manner. With this result we conclude that T50 printer is suitable and cheaper than commercial options. In the second chapter, we focused in characterizing calcium oxalate crystals of amaranth leaves."