Expresión heteróloga de péptidos antiangiogénicos en Pichia pastoris

Abstract

"La vasostatina (Vs30) y la vasoinhibina (Vi-II-14.1) son péptidos inhibidores de la angiogénesis que son derivados de la región N-terminal de la calreticulina y la prolactina humana, respectivamente. Anteriormente, Vs30, Vi-II-14.1 y VS_VI habían sido producidos en E. coli, no obstante, la producción de péptidos terapéuticos en bacterias generalmente requiere de pasos que pueden ser evitados empleando el sistema de Pichia pastoris, como: 1) la extracción de la proteína por lisis células, 2) el procesamiento de cuerpos de inclusión y 3) el análisis de controles adicionales para endotoxinas, las cuales pueden modular la proliferación de células endoteliales. Por lo tanto, en este trabajo de investigación se utilizó a Pichia pastoris como sistema de expresión para producir los péptidos Vs30, Vi-II-14.1 y VS_VI. Además, se propuso obtener la proteína de fusión OSIRIS, la cual consta de la vasostatina, una región de reconocimiento de proteasas MMP-2 y MMP-9, un enlazador GGPGG y la vasoinhibina. OSIRIS tiene como estrategia principal el aprovechar los ambientes tumorales con alta actividad proteolítica con el fin de activar de manera localizada péptidos inhibidores de la angiogénesis. Se desarrolló una batería de vectores de expresión que incluían promotores inducibles o constitutivos, con una copia o múltiples copias del casete de expresión. Posteriormente, se obtuvieron cepas de Pichia pastoris productoras y secretoras de las proteínas Vs30, Vi-II-14.1, VS_VI y OSIRIS. La estrategia para aumentar la producción de Vs30 consistió en utilizar cepas de Pichia pastoris con integraciones múltiples del vector de expresión constitutiva. De esta manera, se alcanzó una cantidad equiparable de 21.07±0.9 mg/L de Vs30 en cultivos en matraz y en biorreactor utilizando una cepa con 4 integraciones del vector de expresión. Vs30 fue purificada por ultrafiltración y se recuperaron 10.4 mg/L con un 98% de pureza. Por otra parte, se realizó la expresión inducible de Vi-II-14.1 en Pichia pastoris, en la cual se alcanzó una producción de 68.5 mg/L. En cuanto a la expresión constitutiva, se obtuvo la cepa p-GS115-Vi la cual secretó 126.8 mg/L de Vi-II-14.1 a las 24 h de cultivo a pH 7. Vi-II-14.1 fue purificada mediante cromatografía de afinidad obteniendo una pureza superior al 90% con una recuperación de 2 mg/L. En conclusión, Pichia pastoris es capaz de producir y secretar los péptidos Vs30, Vi-II-14.1, VS_VI y la proteína de fusión OSIRIS. Este trabajo de tesis presenta estrategias moleculares con las que se aumentó la producción de los péptidos antiangiogénicos como la construcción de vectores multicopia, el uso de distintos promotores y un método novedoso para la obtención de cepas de Pichia pastoris hiperresistentes a G418."

"Vasostatin (Vs30) and vasoinhibin (Vi-II-14.1) are peptides that inhibit angiogenesis and are derived from the N-terminal region of human calreticulina and prolactin, respectively. Previously, Vs30, Vi-II-14.1 and VS_VI were expressed in E. coli, however, the production of therapeutic peptides in bacteria usually requires steps that can be avoided by using Pichia pastoris, such as: 1) protein extraction by cell lysis, 2) processing of inclusion bodies and 3) analysis of additional controls for endotoxins, which can modulate the proliferation of endothelial cells. Therefore, the aim of this thesis was to express Vs30, Vi-II-14.1 and VS_VI in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Furthermore, the OSIRIS fusion protein was proposed, which consists of the vasostatin, a region susceptible to MMP-2 and MMP-9 proteases, a GGPGG linker, and the vasoinhibin. The OSIRIS fusion aims to take advantage of tumor environments with high proteolytic activity in order to locally release peptides that inhibit angiogenesis. A battery of expression vectors was created with the genes of interest including vectors with inducible or constitutive promoters, and with one copy or multiple copies of the expression cassette. Subsequently, producing and secreting strains of the proteins Vs30, Vi-II-14.1, VS_VI and OSIRIS were obtained. The strategy to increase the production of Vs30 comprised of employing protease deficient strains of Pichia pastoris with multiple integrations of the constitutive expression vector. In this way, a comparable amount of Vs30 (21.07 ± 0.9 mg/L) was reached in flasks as well in bioreactor cultures by a strain with 4 integrations of the expression vector. Vs30 was purified by ultrafiltration, whereby 10.4 mg/L was recovered with 98% purity. On the other hand, the inducible expression of Vi-II-14.1 was performed in Pichia pastoris, in which 68.5 mg/L of Vi-II-14.1 was produced. About the constitutive expression, 126.8 mg/L of Vi-II-14.1 was secreted at 24 hours of culture at pH 7 by the p-GS115 strain. Vi-II-14.1 was purified by affinity chromatography with purity above of 90% and a recovery of 2 mg/L. In conclusion, Pichia pastoris is capable of producing and secreting Vs30, Vi-II-14.1, VS_VI, and the OSIRIS fusion protein. This thesis offers the reader a compilation of molecular strategies with which the production of the peptides was increased, such as construction of multicopy vectors, employment of diverse promoters, and a novel method for obtaining G418- hyperresistant strains of Pichia pastoris."