Detección molecular de cuatro especies comunes de Candida a partir de hemocultivos

Abstract

"En este trabajo empleamos oligonucleótidos diseñados en el IPICYT para amplificar secuencias genómicas específicas de las cuatro especies principales causantes de candidemia. Realizamos la identificación de 194 aislados de 89 pacientes atendidos en el INCMNSZ y el INCAN. Encontramos que el 39.7% (n=33) de los casos correspondió a C. albicans, el 23.6% (n=21) a C. glabrata, el 19.1% a C. tropicalis (n=17) y el 12.4% C. parapsilosis (n=11). Además, utilizamos el mismo método para identificar las especies de Candida a partir de hemocultivos positivos para Candida spp. Mediante el protocolo descrito por Ausubel (FP) para la extracción de DNA genómico logramos detectar hasta 105 células/mL con la mayoría de los oligonucleótidos empleados, con una sensibilidad y especificidad del 100%. También logramos detectar hasta 104 células de C. tropicalis y C. parapsilosis y 105 células de C. glabrata y C. albicans a partir de muestras de sangre directamente sin cultivar. Realizamos un análisis de relación genética en 39 aislados de C. glabrata de 15 pacientes con el método RAPD-PCR. Encontramos seis genotipos distintos (I-VI), de los cuales el genotipo I fue el más prevalente pues se encontró en aislados de seis pacientes. Todos los aislados del mismo paciente mostraron el mismo genotipo. Finalmente, analizamos la sensibilidad a fluconazol (FLC) donde el 51.3% (19/37) de los aislados de C. glabrata (algunos provenientes de muestras consecutivas del mismo paciente) fueron resistentes de manera dosis-dependiente a FLC, el 45.9% (17/37) fueron sensibles y solo uno fue resistente a FLC. Además, dos aislados mostraron menor sensibilidad a FLC que otros aislados del mismo paciente. En conclusión, desarrollamos un método de PCR de punto final rápido, altamente sensible y específico para la detección de las cuatro principales especies del género Candida que causan candidemia en hemocultivos y en sangre. En el análisis de la población de C. glabrata observamos correlación genotípica entre los aislados de diferentes pacientes y que algunas cepas tienden a desarrollar resistencia a FLC."

"In this study we used oligonucleotides designed at IPICYT to amplify speciesspecific genomic sequences of the four main species causing candidemia. We determined the distribution of Candida species in 194 clinical isolates from 89 patients from the INCMNSZ and the INCAN. We found that C. albicans corresponds to 39.7% (n=33) of the cases, C. glabrata to 23.6% (n=21), C. tropicalis to 19.1% (n=17) and C. parapsilosis to 12.4% (n=11). We used a method described by Ausubel (FP) for the extraction of genomic DNA from blood cultures positive for Candida spp. With this method we detected 105 cells/mL with a sensitivity and specificity of 100%. We also detected 105 cells of C. glabrata and C. albicans and 104 cells of C. tropicalis and C. parapsilosis directly from blood samples. We then analyzed genetic relatedness using RAPD-PCR analysis on 39 C. glabrata isolates from 15 different patients. We found six different genotypes; genotype I was the most prevalent since it was found in clinical isolates from six different patients, and some genotypes were only found in one patient. All the isolates from the same patient showed the same genotype. Finally, we found that 51.3% 19/37) of the C. glabrata isolates were Fluconazole (FLC) resistant in a dose-dependent manner (FLCdd), 45.9% were sensitive to FLC and only one isolate was FLC resistant. In addition, two isolates displayed a decrease in sensitivity to FLC compared to the other isolates from the same patient. In conclusion, we developed a fast, highly sensitive and specific PCR method for the detection of the four main Candida species that cause candidemia both, in blood cultures and whole blood. Genetic analysis by RAPD-PCR of C. glabrata isolates we observed genotypic relationship between isolates from different patients. In addition, we found that and that some isolates can develop resistance to FLC."