Estudio del promotor AC2 y secuencias que responden al transactivador TrAP en begomovirus

Abstract

"Los miembros del género Begomovirus son los virus de plantas más diversificados y constituyen un factor limitante para la producción agrícola en todas las regiones cálidas del mundo. En este trabajo abordamos aspectos relacionados con el gen AC2/C2/TrAP de los begomovirus (BGVs), que codifica a la proteína TrAP, un activador transcripcional de los genes tardíos del virus, El gen AC2 se traslapa con otros dos genes virales, AC1 y AC3; y su promotor reside en un segmento codificante del genoma viral,. Dos trabajos previos mostraron que el promotor AC2 de MYMV y TGMV, dos BGVs modelo, se traslapa con la mitad 5´ del gen AC1 (Rep). Para obtener un mayor conocimiento del promotor (A)C2, generamos varias versiones truncadas del mismo en tres BGVs diferentes, fusionados al gen reportero GUS. Los análisis funcionales mostraron que la versión más corta (~300 bp) de los promotores de OkYMMV y TYLCV presenta la mayor actividad relativa, lo que indica que los elementos críticos se localizan en la región proximal del promotor. En esa región se localiza una secuencia conservada de 9 pb, que fue identificada en un estudio previo como sitio de unión de un factor transcripcional de la planta. Generamos mutaciones silenciosas en ese elemento dentro del promotor AC2 de PepGMV, y evaluamos su impacto sobre la capacidad infectiva del virus. El efecto fue drástico, pues no se detectó DNA viral en las hojas nuevas en ninguna de las 19 plantas inoculadas con el virus mutante. Este fenotipo no fue causado por una alteración de la proteína Rep, ya que el mutante conservó la capacidad de autorreplicarse al mismo nivel que el virus silvestre.. En este estudio analizamos plantas transgénicas con promotores sintéticos que contienen de una a 6 copias del CLE (“Conserved Late Element”). Se demostró que los CLEs son reconocidos por factores de la planta, pues el gen reportero se expresó a niveles elevados en ausencia de proteínas virales. Esa expresión se incrementó con la infección viral. La demostración más clara de que el CLE es un elemento de respuesta a TrAP la obtuvimos analizando el promotor CP de TGMV, otro BGV modelo, El promotor truncado en la posición -125 fue transactivado por TrAP, pero la mutación del CLE abolió la respuesta a TrAP; más aún, la adición de un CLE sintético al extremo 5´ del promotor -125 potenció el nivel de transactivación por el factor viral. Estos resultados demuestran que el CLE es, efectivamente, un elemento de respuesta a TrAP. Finalmente, realizamos un análisis comparativo muy amplio de los promotores CP de geminivirus, e identificamos un elemento complejo conservado de 20-25 pb que exhibe simetría de díada parcial. Este elemento bipartita fue denominado TACE (“TATA box-associated composite element”), y contiene o se asocia a CLEs en la mayoría de los BGVs descritos a la fecha. Proponemos que el TACE está involucrado en la desrrepresión del gen CP en el tejido vascular de las plantas, un proceso mediado por TrAP."

"Members of the genus Begomovirus are the most diversified plant viruses (> 430 species) and constitute a limiting factor for agricultural production in all warm regions of the world. In this work we address several aspects related to the AC2/C2/TrAP gene of the begomoviruses (BGVs), which encodes the TrAP protein, a transcriptional activator of the virus late genes. The AC2 gene overlaps with two other viral genes, AC1 and AC3; and its promoter resides in a coding segment of the viral genome, which has made its study difficult. Two previous works showed that the AC2 promoter of MYMV and TGMV, two BGV models, overlap with the 5' half of the AC1 (Rep) gene. To obtain a better knowledge of the (A)C2 promoter, we generated several truncated versions of it in three different BGVs, fused to the GUS reporter gene. The functional analyzes showed that the shorter version (~300 bp) of the OkYMMV and TYLCV promoters displays the highest relative activity, hence indicating that the critical regulatory elements are located in the promoter proximal region, where a conserved sequence of 9 bp is located, which was identified in a previous study as the binding site for a plant transcription factor. We generate silent mutations in that element within the AC2 promoter of PepGMV, and we evaluate its impact on the infective capacity of the virus. The effect was drastic, since no viral DNA was detected in the new leaves in any of the 19 plants inoculated with the mutant virus. This phenotype was not caused by an alteration of the Rep protein, since the mutant retained the ability to self-replicate at the same level as the wildtype virus. The TrAP protein regulates the expression of late genes by mechanisms that are not fully understood yet. In this study we analyze transgenic plants with synthetic promoters that contain from one to 6 copies of the CLE ("Conserved Late Element"). It was shown that CLEs are recognized by plant factors, since the reporter gene was expressed at high levels in the absence of viral proteins. That expression increased with the viral infection. The clearest demonstration that the CLE is a TrAP responsive element was obtained by analyzing the CP promoter of TGMV. The truncated promoter at position -125 was transactivated by TrAP, but the CLE mutation abolished the response to the viral transactivator; moreover, the addition of a synthetic CLE to the 5'-end of the -125 promoter increased the level of transactivation by the viral factor. These results showed that the CLE is, effectively, an element of response to TrAP. Finally, we performed a very broad comparative analysis of the CP promoters of geminiviruses, and we identified a conserved complex element 20-25 bp long, that exhibits partial dyad symmetry. This bipartite element was named TACE ("TATA box-associated composite element"), and it contains or is associated with CLEs in most of the BGVs described to date. We propose that TACE is involved in the derepression of the CP gene in the plant vascular tissues, a process mediated by TrAP."