Optimización de la transformación genética de alfalfa para la expresión de epítopos relevantes de Bordetella pertussis

Abstract

"La tos ferina es una enfermedad infecciosa aguda, altamente contagiosa, de las vías respiratorias altas. En las últimas décadas la incidencia de esta enfermedad causada por la bacteria Bordetella pertussis ha aumentado en los países en desarrollo, e incluso se han presentado casos en niños y adolescentes que fueron previamente vacunados, por lo que el desarrollo de una vacuna contra la tos ferina que inmunice de modo eficiente y a bajo costo, es particularmente importante para países del Tercer Mundo. En este sentido, la producción de proteínas antigénicas en plantas es una alternativa económicamente viable. Este trabajo se enfoca a la expresión de epítopos relevantes de B. pertussis y moléculas adyuvantes, en plantas transgénicas de alfalfa (Medicago sativa), como primer paso en el desarrollo de una vacuna mejorada contra la tos ferina. Para ello, se estandarizaron y optimizaron las condiciones de transformación y regeneración de este sistema vegetal para la expresión de las proteínas de interés. Se probaron 5 diferentes cepas de Agrobacterium tumefaciens (C58C1, C58/GV3101, GV3101, GV3010 y LBA4404) que contenían el vector binario pBI121 y se evaluaron 3 protocolos diferentes de transformación, usando plántulas, embriones maduros e hipocotilos maduros como material inicial. La transformación de las plantas fue confirmada por PCR y el ensayo histoquímico de la actividad de la glucoronidasa La mayor eficiencia de transformación (30%) se logró empleando la cepa de A. tumefaciens GV3010 e hipocotilo como explante inicial, por lo que concluímos que éste es un método eficiente para introducir los genes de interés biofarmacéutico en la variedad de alfalfa CUF 101. Finalmente, se diseñó un gen sintético para la transformación nuclear, el cual codifica varios epítopos relevantes de B. pertussis, como algunos derivados de la hemaglutinina, pertactina, toxina pertúsica y fimbria, además de una secuencia adyuvante derivada de E. coli enterotoxigénica. Este gen sintético formado con secuencias cortas de varios genes se clonó en un vector binario y será utilizado para la transformación nuclear de alfalfa."

"Whooping cough is an acute highly contagious disease of upper respiratory tract. In the last decades the incidence of this disease caused by bacteria Bordetella pertussis has increase in the developing countries and there have been cases in children and teenagers who had been vaccinated; therefore development of vaccine against whooping cough that can effectively immunize at a low-cost, is particularly important for Third World countries. In this sense, the production of antigenic proteins in plants is an economically feasible alternative. This work focuses on the expression of relevant epitopes of B. pertussis and an adjuvant, in transgenic alfalfa plants (Medicago sativa), as a first step in the development of an improved vaccine against whooping cough. For this purpose, we standardized and optimized the transformation and regeneration conditions for the expression of proteins of interest in this plant system. Five different strains of Agrobacterium tumefaciens (C58C1, C58/GV3101, GV3101, GV3010 and LBA4404) harboring the binary vector pBI121 were tested. Furthermore, three different transformation protocols were evaluated using seedlings, mature embryos and mature hypocotyls as starting material. Plant transformation was confirmed by PCR and the glucoronidase activity histochemical assay. The highest transformation efficiency (30%) was obtained by using A. tumefaciens strain GV3010 and hypocotyls as starting material, thus we conclude that this is an efficient transformation method to introduce genes of biopharmaceutical interest into alfalfa var CUF101. Finally, a synthetic gene was designed for the nuclear transformation of alfalfa. This synthetic gene has several relevant epitopes from B. pertussis such as some derived from hemagglutinin, pertactin, pertussis toxin and fimbria and an adjuvant sequence derived from an enterotoxigenic E. coli. This synthetic gene that harbors short sequences of several genes was cloned into a binary vector and will be used for alfalfa nuclear transformation."