Producción de péptidos contra influenza A H1N1 en Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

"La infección por el virus de la influenza es la mayor causa de las enfermedades respiratorias en el mundo. El virus tiene mecanismos para la evasión del sistema inmune y para crear nuevas cepas pandémicas, por tal razón, las vacunas deben actualizarse anualmente. El objetivo del este trabajo fue expresar un péptido antigénico basado en epítopos conservados del virus de la influenza A H1N1 y del péptido antiviral bloqueador de entrada (EB), en la microalga Chlamydomonas reinhardtii, ya que es un sistema rápido y económico para producción de proteínas recombinantes. Los genes del péptido antigénico y del péptido antiviral EB se diseñaron con base en ensayos in silico y se optimizaron para su expresión en la microalga tanto para la transformación nuclear como en el cloroplasto. Las construcciones para expresión nuclear se clonaron en el vector pChlamy_1 y se transformaron vía Agrobacterium tumefaciens. Para la transformación de los cloroplastos por biobalística se usó el vector p463. Las líneas transgénicas nucleares y transplastómicas para el gen EB fueron confirmadas por PCR, al igual que para el gen de resistencia APH7 y para corroborar la homoplastia. El dot blot indicó que el péptido EB en la línea transplastómica se acumula en la fracción insoluble, sin embargo, no se pudo detectar el péptido EB por dot blot en las líneas transgénicas. La cuantificación de la proteína realizada por ELISA mostró que las líneas transgénicas nucleares producen de 0.3 a 1.8 ?g de del péptido EB por cada gramo de biomasa húmeda; mientras que, para la líneas transplastómicas, se obtiene de 0.09 a 18 ?g del péptido EB por gramo de biomasa húmeda. La transformación nuclear de la construcción PA-pChlamy_1 permitió la obtención de 170 clonas resistentes a higromicina, mientras que la transformación del cloroplasto permitió la obtención de 500 clonas resistentes a espectinomicina. Estamos por realizar el análisis de efectividad biológica del péptido EB en líneas celulares y la efectividad de las proteínas antigénicas en ratones para detectar la producción de anticuerpos y demostrar su funcionalidad. Los resultados preliminares indican que es posible utilizar a C. reinhardtii como plataforma para la producción de péptidos que posiblemente que ayuden a combatir al virus de la influenza."

"Influenza infections are the major cause of respiratory diseases in the world. The viruses have evasion mechanisms of the immune system, so new pandemic strains can arise. For this reason, the influenza vaccines need to be redesigned annually. The aim of the current work was to express an antigenic peptide based on the conserved epitopes from influenza virus A H1N1 and the antiviral peptide entry blocker (EB) in Chlamydomonas reinhardtii, which is a fast and economic system for recombinant protein production. Antigenic peptide genes and antiviral peptide, were designed with in silico assays and were optimized for algae expression both for nuclear and chloroplast transformation. Constructs for nuclear expression were cloned in the pChlamy_1 vector and were transformed via Agrobacterium tumefaciens. For chloroplast transformation, via biolistic, p463 vector was used. Nuclear transgenic and transplastomic lines from EB gene were confirmed by PCR, they were also tested for the presence of resistance gene and for homoplasty. Dot blot indicated that EB peptide in the transplastomic lines was accumulated in the insoluble fraction, however was not detected by dot blot in the transgenic line. ELISA protein quantitation showed that nuclear transgenic lines produced between 0.3 to 1.8 ?g per gram of wet biomass. While for transplastomic lines, 0.09 to 18 ?g EB peptide per gram of wet biomass was obteined. We obtained 170 hygromycin resistant clones for PA-pChlamy_1 nuclear transformation and 500 spectinomycin resistant clones for chloroplast transformation. We will perform biological assays to test the activity of EB peptide in cellular lines and also the biological assay of antigenic proteins in mice to demonstrate if they have biological activity. Preliminary results showed that is possible to use C. reinhardtii as a platform to produce recombinant peptides that perhaps can fight the influenza virus."