Obtención de plantas de tomate (Solanum lycopersicum) sobreexpresantes del gen SCE1, como candidato a conferir resistencia contra Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis

Abstract

"El tomate (Solanum lycopersicum), es la hortaliza que se cultiva a mayor escala en el mundo. Sin embargo, enfermedades como el cáncer bacteriano causado por la bacteria Gram positiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), constituyen uno de los factores limitantes más importantes en su producción. El control convencional que se utiliza para enfermedades bacterianas de tomate implica el uso de agroquímicos, como compuestos derivados de cobre, sales cuaternarias de amonio, o antibióticos, que no han sido muy efectivos contra Cmm, lo que ha provocado pérdidas económicas importantes en el país y el mundo entero. En este sentido, la obtención de cultivares de tomate resistentes a este patógeno sería una estrategia de control favorable para el ambiente al reducir el uso de agroquímicos. Este trabajo se enfoca en lograr la sobreexpresión del gen SCE1 en tomate, el cual, de acuerdo a resultados obtenidos previamente por nuestro grupo de trabajo, parece estar involucrado en la resistencia a Cmm, ya que su silenciamiento por RNA interferente aumentó la susceptibilidad de las plantas a infecciones por esa bacteria. Para cubrir ese objetivo, se estandarizó un protocolo de transformación en un tomate comercial S. lycopersicum var. Ailsa Craig, usando hipocotilos como explante inicial y se evaluó la eficiencia de transformación probando cuatro cepas de Agrobacterium tumefaciens: c58, GV3101, LBA4404 y GV3010, que albergan un vector binario para la expresión del gen SCE1 bajo la regulación del promotor 35S CaMV, así como una regeneración eficiente de las plantas transformadas. La transformación de las plantas fue confirmada mediante la técnica de PCR para el transgén SCE1 y el marcador de selección nptII. La cepa de A. tumefaciens que presentó un mejor balance entre la eficiencia de transformación (18%) y supervivencia (54%) fue la GV3101. Adicionalmente, se analizaron cuatro de las líneas T0 obtenidas mediante un análisis de RT-PCR semicuantitativo que reveló la sobreexpresión constitutiva del gen SCE1. También se realizó un análisis por Southern blot que mostró la inserción del TDNA en al menos una de las líneas T0 sobreexpresantes, por lo que concluimos que éste es un método eficiente, y rápido para introducir genes de interés en tomate; el próximo paso es someter a reto con Cmm a las plantas sobreexpresantes del gen SCE1."

"The tomato (Solanum lycopersicum) is the world's most important horticultural crop. However, plant diseases such as the bacterial canker caused by the Gram positive bacteria Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) are one of the most important production limiting factors. Conventional control used in bacterial diseases in tomato involves the use of chemicals such as copper derivative compounds, quaternary ammonium salts, or antibiotics, which have not been effective against Cmm, resulting in significant economic losses in the country and worldwide. Therefore to obtain tomato cultivars resistant to this pathogen could be a suitable strategy for the environment by reducing the use of chemicals. This work focuses on the over-expression of SCE1 gene in tomato, which was previously validated in our group by gene silencing, demonstrating its putative role to confer resistance to Cmm. For this, a transformation protocol in the commercial tomato S. lycopersicum var. Ailsa Craig was standardized using hypocotyls as initial explants, and the transformation efficiency was evaluated by testing four strains of Agrobacterium tumefaciens C58, GV3101, LBA4404 and GV3010 harboring a binary vector for the expression of the SCE1 gene driven by the CaMV 35S promoter; efficient regeneration of the transformed plants was also evaluated. The transformant plants were confirmed by PCR for the transgenes SCE1 and nptII. The strain of A. tumefaciens that had the best balance between transformation efficiency (18%) and survival (54%) was GV3101. Additionally, four of the T0 lines obtained were analyzed by semi-quantitative RT-PCR assay, and showed constitutive overexpression of SCE1 gene. Also, a Southern blot analysis showed that at least one T0 overexpressing plant had the T-DNA insertion. Therefore we conclude that this is an efficient and fast method to introduce genes into tomato plants, and the next step is the challenge of the SCE1 overexpressing plants against Cmm."