Análisis funcional del gen SCEI relacionado con resistencia bacteriana en tomate silvestre mediante un vector viral y CRISPR/Cas9

Abstract

"El tomate (Solanum lycopersicum) es una de las hortalizas de mayor interés económico a nivel mundial, sin embargo, es un cultivo susceptible a diversos patógenos, entre los que sobresale C. michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), bacteria causante de la devastadora enfermedad del chancro bacteriano del tomate. Dicha enfermedad se ha propagado rápidamente por todo el mundo, causando grandes pérdidas económicas porque no existen tratamientos curativos o preventivos eficientes. En el 2011, Lara-Ávila llevó a cabo un análisis de la expresión génica de un cultivar comercial y dos especies silvestres de tomate, en el curso de sus interacciones con Cmm, en el que identificó diversos genes que se sobreexpresaron horas después de la infección. Uno de éstos genes fue el que codifica a la enzima de conjugación SUMO E2 (SCEI) la cual interviene en el proceso de sumoilación, sugiriendo que juega un papel en la respuesta de defensa temprana. Por lo anterior, el objetivo de mi trabajo fue realizar un estudio funcional del gen SCEI y de sus parálogos, utilizando dos estrategias diferentes: a) silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y, b) la generación de un knockout de SCEI por la tecnología de CRISPR/Cas9. En ambos casos, la finalidad fue corroborar si el gen SCEI está involucrado en la defensa de la planta, y si es un gen esencial para el desarrollo de la misma. El vector viral para VIGS que contiene un fragmento del gen SCEI fue introducido por biobalística en las especies silvestres de tomate S. arcanum 2172 y 2157, y 60 días después fueron retadas con Cmm. Se analizó la expresión de SCEI y de sus 3 parálogos por RT-qPCR, 8 horas después del reto y se monitoreó, a la vez, el fenotipo de las plantas sanas y enfermas. Para la obtención de un knockout por CRISPR/Cas9 se clonaron guías específicas en el vector que contiene la endonucleasa Cas9 y otros componentes esenciales para el sistema, luego los vectores fueron usados para la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de plantas de tomate, utilizando el sistema de co-cultivo y sonicación. Se obtuvieron diferentes niveles de silenciamiento en S. arcanum 2172 tanto para SCEI como de sus 3 parálogos, mismos que correlacionaron con el fenotipo de susceptibilidad observado en las plantas, lo cual indica que SCEI juega un papel en la defensa de respuesta temprana en la planta. Por el contrario, la especie más resistente, S. arcanum 2157 no presentó un claro desarrollo de la enfermedad, por lo que no fue necesario analizar el grado de silenciamiento del gen en cuestión. Finalmente, con la estrategia de CRISPR/Cas9 se lograron transformar explantes de S. lycopersicum cv. Ailsa Craig y Micro-Tom, pero los resultados de secuenciación revelaron que no hubo edición génica alguna, probablemente porque la Cas 9 no está funcionando adecuadamente in planta. Es necesario estandarizar los protocolos de transformación tanto de biobalística como de Agrobacterium."

"The tomato (Solanum lycopersicum) is one of the vegetables of higher production and economic interest worldwide, however, it is susceptible to different pathogens attack, where outstands C. michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), a bacteria causative of the devastating disease the bacterial canker. This disease has rapidly propagated around the world, causing high economic losses since there are not efficient curative or preventive treatments. In 2011, Lara-Avila performed a genetic expression analysis during the interaction of commercial tomato and wild type species with Cmm, where he identified diverse genes that were overexpressed hours later after the infection. One of these genes was the one encoding the SUMO E2 conjugation enzyme (SCEI), which participates in the sumoylation process, suggesting that it plays a role on the early defense response. Therefore, the aim of this work was to develop a functional analysis of SCEI gene and its paralogous through two approaches: a) the virus-induced gene silencing strategy (VIGS) and b) the generation of a SCEI gene knockout by the CRISPR/Cas9 technology to corroborate if it is involved in the plant defense and if it is an essential gene for the development of it. The viral vector for VIGS harboring a fragment of the SCEI gene was introduced by biolistic in the wild tomato species S. arcanum 2172 and 2157, and 60 days later they were challenged with Cmm. The expression of SCEI and 3 paralogous was analyzed 8 hours after the challenge by RT-qPCR and at the same time, the phenotype of the healthy and diseased plants was recorded. To obtain the knockout by CRISPR/Cas9, specific guides were cloned into a vector harboring the endonuclease Cas9 and other essential components for the system. Then, the vectors were used for the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of tomato plants using the co-culture system and sonication. Different silencing levels were obtained in S. arcanum 2172 both for SCEI and the paralogous, which correlated with the susceptible plant phenotypes observed, indicating that SCEI plays a role in plant early defense response. Conversely, S. arcanum 2157, the most resistant specie, did not show a clear development of the disease, therefore it was not necessary to analyze the silencing level of SCEI. Finally, with the CRISPR/Cas9 strategy we managed to transform explants from S. lycopersicum cv. Ailsa Craig and Micro-Tom, however, the sequencing results obtained indicate that there was not gene edition at all, probably because the Cas 9 is not working properly in planta. It is necessary to standardize the transformation protocols both for ballistic and Agrobacterium."