Análisis funcional de promotores derivados de geminivirus en la microalga Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

"El uso de la microalga verde Chlamydomonas reinhardtii como plataforma biológica para la producción de proteínas recombinantes, es prometedor por sus elevados rendimientos, bajo costo de producción, obtención de proteínas funcionales, y por considerarse a esta microalga como segura para el consumo humano. La utilización de vectores virales para la producción de proteínas heterólogas en microalgas tiene enorme potencial biotecnológico, pero es una línea de investigación escasamente desarrollada. En el presente trabajo exploramos la funcionalidad de varios promotores provenientes de geminivirus, en C. reinhardtii, con el propósito de determinar su utilidad como parte de un sistema basado en elementos genéticos virales que se integre al genoma de la microalga y se escinda luego para replicarse como episoma. El promotor Rep del Virus Chino del Tomate de La Paz, ToChLPV, y los promotores Rep y CP de dos aislados del Virus del Rizado Amarillo del Tomate, TYLCV-Sin y TYLCV-SLP, con marcadas diferencias en el fenotipo infectivo, fueron fusionados transcripcionalmente a los genes reporteros GUS y GFP, e integrados a vectores de expresión derivados de los plásmidos binarios pBI121 y pChlamy_1. Para la construcción de los vectores virales utilizamos oligonucleótidos sintéticos con sitios únicos para endonucleasas específicas. Los vectores generados fueron examinados experimentalmente en células de Chlamydomonas transformadas por cepas de Agrobacterium tumefaciens portadoras de los plásmidos binarios modificados. La funcionalidad y potencia relativa de los promotores geminivirales fue evaluada por medio de técnicas histoquímicas, inmunoensayos y el uso de microscopía de fluorescencia. La evidencia de los ensayos histoquímicos y de Dot Blot demostraron la funcionalidad de los promotores virales en la microalga, siendo los de Rep de ToChLPV y el de CP de TYLCV-Sin los más activos. Estos resultados abren la posibilidad de usar estos promotores para la sobreexpresión de proteínas recombinantes en microalgas."

"The use of the green microalgae Chlamydomonas reinhardtii as a biological platform for the production of recombinant proteins, is promising due to the high yields, low production costs, rending functional proteins and also because is recognized as safe for human consumption. The employment of viral vectors for the overexpression of heterologous proteins in microalgae, has a huge biotechnological potential, but is a research area sparsely developed. In the present work, we explored the functionality of several promoters from geminiviruses, in C. reinhardtii, with the aim of determine their use as part of a system based on geminiviral genetics elements to integrate into the microalgae genome and to split-out as an episome and replicate. The Rep promoter from Tomato Chino La Paz Virus, ToChLPV, the Rep and CP promoters from two isolated of the Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV-Sin and TYLCV-SLP, with strong differences in the infective phenotype, were merged transcriptionally to the GUS and GFP reporter genes, and integrated to the expression vectors derived from binary plasmids pBI121 and pChlamy_1. For the construction of the viral vectors we used synthetic oligonucleotides with unique sites for specific endonucleases. The generated vectors were analyzed experimentally into Chlamydomonas cells transfected by Agrobacterium tumefaciens strains harboring the modified binary plasmids. The functionality and relative strength of the geminiviral promoters were evaluated by histochemical techniques, immunoassays and fluorescence microscopy analyses. The evidence from histochemical and Dot Blot assays demonstrated the functionality of the viral promoters at microalgae, being the strongest promoters Rep ToChLPV and the CP of the TYLCV-Sin. These results open the possibility to use these promoters for overexpression of recombinant proteins into microalgae."