El factor de transcripción Gln3 y la proteína Ure2 forman un complejo en Candida glabrata

Abstract

"En levaduras como Saccharomyces cerevisiae, los compuestos nitrogenados se internalizan a la célula y se utilizan a través de diversas vías metabólicas. Estos compuestos se usan en la síntesis de proteínas, como precursores para la síntesis de otros aminoácidos o bien para el metabolismo de azúcares. Sin embargo, no todas las fuentes de nitrógeno se usan de la misma forma. En S. cerevisiae, el factor de transcripción Gln3 induce la expresión de permeasas y enzimas catabólicas de acuerdo a las fuentes de nitrógeno disponibles. A esta regulación se le conoce como Represión Catabólica Nitrogenada (NCR por sus siglas en inglés). La NCR se ha estudiado en varios organismos como S. cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus fumigatus y en Candida glabrata. Recientemente en nuestro laboratorio, se identificaron en C. glabrata, los ortólogos de GLN3 y URE2 (represor de la actividad de Gln3) de S. cerevisiae. Se crecieron la cepa de C. glabrata silvestre y cepas mutantes en GLN3 y URE2 en diferentes fuentes de nitrógeno. Se compararon los fenotipos de crecimiento y la expresión de genes ortólogos bajo el control transcripcional de Gln3 (MEP2, GAP1, GLN1 y PUT4). La ausencia de GLN3 en C. glabrata provoca alteraciones en el crecimiento y en la expresión de los genes arriba mencionados. La ausencia de Ure2 tiene alteraciones en el crecimiento cuando amonio o glutamina son las únicas fuentes de nitrógeno. En este trabajo de tesis buscamos probar si Gln3 y Ure2 de C. glabrata, interactúan formando un complejo proteína-proteína como lo reportado para los ortólogos de S. cerevisiae, usando la técnica de Complementación Bi-molecular de Fluorescencia acoplada a Citometría de flujo (BiFC-FC por sus siglas en inglés). Para ello, construímos proteínas quiméricas entre los fragmentos carboxilo y amino terminales de la proteína amarilla Venus y a los extremos amino y carboxilo terminales de Gln3 y Ure2 en una cepa doble mutante gln3Δ ure2Δ. Con el fin de evaluar la funcionalidad de las quimeras de Gln3 y Ure2 en comparación con la cepa silvestre, hicimos curvas de crecimiento y medimos la expresión de GAP1, que depende de Gln3, en medios con amonio o prolina como únicas fuentes de nitrógeno. Observamos que las proteínas quiméricas de Gln3 y Ure2 son funcionales y forman un complejo en C. glabrata."

"In yeasts like Saccharomyces cerevisiae, nitrogen compounds are internalized to the cell and metabolized through various metabolic pathways. These compounds are used for protein synthesis, as precursors in amino acids synthesis or in sugars’ metabolism. However, not all nitrogen sources are used in the same way. In S. cerevisiae, the transcription factor Gln3 induces the expression of permeases and catabolic enzymes according to the available nitrogen sources, through a mechanism called Nitrogen Catabolic Repression (NCR). The existence of the NCR has been studied in several organisms such as S. cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus fumigatus and in Candida glabrata. Recently in our laboratory, the S. cerevisiae orthologs of GLN3 and URE2 (a Gln3 repressor), were identified in C. glabrata. The C. glabrata wild type and mutant strains in GLN3 and URE2 were grown in different nitrogen sources. Growth phenotypes and the expression of orthologous genes that are under the transcriptional control of Gln3 (MEP2, GAP1, GLN1 and PUT4) were compared. In C. glabrata, GLN3 deletion causes growth alterations and different expression levels of the above mentioned genes. Ure2 absence presents growth alterations when ammonium or glutamine are the only nitrogen sources available. In this thesis work we seek to test, using the Bi-molecular Fluorescence Complementation technique coupled to Flow Cytometry (BiFC-FC), if Gln3 and Ure2 of C. glabrata interact to form a protein-protein complex as reported for S. cerevisiae orthologs. To do this, we constructed chimeric proteins between the carboxyl and amino terminal fragments of the Venus yellow protein and the amino and carboxyl terminal ends of Gln3 and Ure2 in a gln3Δ ure2Δ double mutant strain. In order to evaluate the functionality of the Gln3 and Ure2 chimeras compared to the wild type strain, we made growth curves and measured the expression of GAP1, which depends on Gln3, in media with ammonia or proline as sole nitrogen sources. We show that Gln3 and Ure2 chimeric proteins are functional and form a complex in C. glabrata."