Activación por voltaje del canal de cloruro activado por calcio, TMEM16A

Abstract

"TMEM16A es un canal de cloruro activado por calcio que controla el transporte de líquido epitelial, la contracción del músculo liso, el bloqueo de la poliespermia y la liberación de insulina, entre otros. La activación de TMEM16A es un mecanismo complejo que requiere incrementos de calcio intracelular y despolarizaciones de la membrana plasmática. TMEM16A no tiene un sensor de voltaje canónico, sin embargo, puede ser activado por la diferencia de voltaje a través de la membrana, aunque el mecanismo aún no está claro. En este trabajo mostramos que el canal TMEM16A silvestre se activa por voltaje en ausencia de calcio. Las corrientes muestran una fuerte rectificación saliente, la activación es muy rápida (<1 ms) y no presentan corrientes de cola. La corriente activada por voltaje depende del anión permeante y se inhibe por los ácidos tánico y antraceno-9-carboxílico. La amplitud de la corriente activada por voltaje es pequeña, sin embargo, se incrementa al eliminar los residuos 448EAVK451 en el primer asa intracelular y al mutar los residuos E702Q-E705Q que forman parte del sitio de unión de calcio. La mutación o eliminación de los residuos 444EEEEEAVK451 modula la activación por calcio y por voltaje, pero no explica la dependencia con el voltaje de TMEM16A. En este trabajo planteamos la hipótesis de que la titulación dependiente de voltaje de los residuos del sitio de unión de calcio permite la activación de TMEM16A. Para probar esto, registramos la actividad del canal a diferentes concentraciones de protones intracelulares. A medida que aumentaba la concentración de protones, incrementaba la corriente activada por voltaje. Para demostrar que estaban involucrados los residuos del sitio de unión de calcio, mutamos los residuos Glutámico / Aspártico a glutamina (para simular un Glutámico protonado permanente). Los canales mutados fueron más fáciles de activar a pH fisiológico. En particular, la respuesta de estos canales mutados a la acidificación intracelular disminuyó y se volvió independiente del voltaje. En conclusión, la protonación dependiente de voltaje de los residuos glutámico / aspártico del sitio de unión de calcio, resalta la activación de TMEM16A por voltaje en ausencia de calcio intracelular. Las corrientes resultantes fueron rápidas, sostenidas y lo suficientemente grandes como para regular la excitabilidad eléctrica."

"TMEM16A is a calcium-activated chloride channel that controls epithelial fluid transport, smooth muscle contraction, polyspermia blockade, and insulin release, among others. Activation of TMEM16A is a complex mechanism that requires increases in intracellular calcium and depolarizations of the plasma membrane. TMEM16A does not have a canonical voltage sensor, however it can be voltage- activated, although the mechanism is still unclear. In this work we show that the wild- type TMEM16A channel is voltage-activated in the absence of calcium. The currents show a strong outward rectification, the activation is very fast (<1 ms) and did not present tail currents. The voltage-gated current is dependent on the permeating anion and is inhibited by tannic and anthracene-9-carboxylic acids. The amplitude of the voltage-gated current is small; however, it is increased by eliminating the 448EAVK451 residues in the first intracellular loop and by mutating the E702Q- E705Q residues that are part of the calcium binding site. Mutation or deletion of residues 444EEEEEAVK451 modulates calcium and voltage activation but does not explain the voltage dependence of TMEM16A. In this work we hypothesize that voltage-dependent titration of calcium-binding site residues enables activation of TMEM16A. To test this, we record channel activity at different concentrations of intracellular protons. As the concentration of protons increased, the voltage-gated current increased. To demonstrate that calcium binding site residues were involved, we mutated the Glutamic / Aspartic residues to glutamine (to simulate a permanent protonated Glutamic). Mutated channels were easier to activate at physiological pH. In particular, the response of these mutated channels to intracellular acidification decreased and became independent of voltage. In conclusion, the voltage-dependent protonation of the glutamic / aspartic residues of the calcium binding site highlights the activation of TMEM16A by voltage in the absence of intracellular calcium. The resulting currents were fast, sustained, and large enough to regulate electrical excitability."