Análisis de elementos de respuesta a AC2/TrAP en promotores del begomovirus PHYVV por métodos de expresión transitoria in planta

Abstract

"El virus huasteco de las venas amarillas del chile (PHYVV) es un miembro del género Begomovirus y un excelente modelo para estudiar procesos virales básicos. Su genoma está compuesto por dos moléculas de ADN circular de cadena sencilla (ADNcs), denominados ADN-A y ADN-B. PHYVV regula finamente la expresión de sus genes en el tiempo: los genes tempranos se expresan por factores de la planta, y los genes tardíos requieren de proteínas virales producidas al inicio del ciclo infectivo. El ADN-A codifica a la proteína de la cápside (CP) y el ADN-B a la proteína NSP (“nuclear shuttle protein”). Ambas proteínas unen a ADNcs que dan origen a ADNcd que actúa como intermediario para la transcripción y para la replicación del DNA viral. Los promotores de los genes tardíos son regulados por una proteína denominada AC2 o TrAP, la cual actúa por dos mecanismos: por des-represión en tejido vascular, y por activación en el mesófilo. En el caso del begomovirus TGMV. Los promotores CP y NSP fusionados a un gen reportero lo expresan en ausencia de TrAP si se elimina un silenciador que se encuentra ~1.2- 1.5 Kpb corriente arriba del gen, en tanto que es activado por TrAP en mesófilo si están presentes ciertos elementos activadores cercanos al gen. Es importante que los genes CP y NSP no se expresen sino hasta que se haya acumulado suficiente ADNcs para no interferir con la replicación y la transcripción viral. Consecuentemente, los genes están inactivos en ausencia de TrAP. El ADN-A de PHYVV, tiene un promotor CP que es regulado por un silenciador, pero plantas transgénicas de tabaco que contienen el promotor NSP fusionado a GUS presentaron fuerte actividad del gen reportero en varios tejidos, en ausencia de factores virales. Para verificar esta observación realizamos experimentos de expresión transitoria in planta, agroinfiltrando en N. benthamiana varias construcciones con el promotor NSP fusionado a GUS. Por medio de esta metodología se verificó que el promotor NSP de PHYVV está activo en varios tejidos en ausencia de TrAP, confirmando las observaciones hechas independientemente en plantas transgénicas. Se discute sobre el significado funcional de esas diferencias Se delimitó además una region de 259 pb del promotor BV1/NSP que responde a TrAP y que incluye varios elementos cis-reguladores que han sido implicados en la transactivación de los genes tardíos de begomovirus. El vector de expresión 35S::AC2-nos se utilizó para probar la capacidad de respuesta a AC2/TrAP de cuatro vectores derivados de pBI(-693)CP::GUS, que se utilizarán para delimitar con más precisión al hipotético silenciador del promotor CP de PHYVV, en plantas transgénicas. Todos los vectores mostraron clara respuesta a la agroinfiltración con el vector de expresión de TrAP."

"The pepper huasteco yellow vein virus (PHYVV) is a member of the genus Begomovirus and an excellent model for studying basic viral processes. Its genome is composed by two single-stranded circular DNA (ssDNA) molecules, called DNA-A and DNA-B. PHYVV finely regulates the expression of its genes over time: early genes are expressed by plant factors, and late genes require viral proteins produced in the previous infective cycle stage. DNA-A codes for the coat protein (CP) and DNA-B for the nuclear shuttle protein NSP. Both proteins bind viral ssDNA that give rise to dsDNA that acts as an intermediate for transcription and replication of virus DNA. Promoters of late genes are regulated by a protein called AC2 or TrAP, which acts by two mechanisms: by derepression in vascular tissue, and by activation in the mesophyll. The CP and NSP promoters fused to a reporter gene express it in the absence of TrAP if a silencer that is ~ 1.2-1.5 Kbp upstream of the gene is not present, while it is activated by TrAP in mesophyll when certain activator elements are present close to the gene. It is important that the CP and NSP genes would not be expressed until enough ssDNA has accumulated in order to not interfere with viral replication and transcription. Consequently, late genes are not expressed in the absence of TrAP. PHYVV A-DNA has a CP promoter that is regulated by a tissue-specific silencer; however, in an unpublished study it was observed that transgenic plants containing the PHYVV NSP promoter fused to the uidA reporter gene exhibited strong GUS activity in several tissues, in the absence of viral factors. To verify this peculiar observation, we carried out transient expression experiments in planta, agroinfiltrating in N. benthamiana several constructions with the NSP promoter fused to GUS. By means of this methodology, it was determined that the PHYVV NSP promoter is strongly active in several tissues in absence of TrAP, thus confirming the perplexing observations in transgenic plants. The functional significance of those differences between the late genes of both genome components of PHYVV is broadly discussed. A 259 bp region of the BV1 /NSP promoter that is strongly responsive to TrAP and contains several cis-regulatory elements that have been implicated in the transactivation of begomovirus late genes was also delimited in this study. The expression vector 35S::AC2-nos was also used to test the responsiveness to TrAP of four vectors derived from pBI(-693) CP::GUS, which will be used to more precisely delimitate the hypothetical silencer of the CP promoter of PHYVV, in transgenic plants. All vectors showed a clear response to agroinfiltration with the TrAP expression vector."