Identificación de determinantes de especificidad de la proteína de replicación de begomovirus y un elemento activador conservado en los promotores de Rep

Abstract

"En este documento se describen tres trabajos independientes pero relacionados, sobre begomovirus. En el primer estudio se analizó la compatibilidad replicativa de dos cepas de Rhynchosia golden mosaic Sinaloa virus (RhGMSV), las cuales presentan iterones diferentes en su origen de replicación; se demostró que las cepas de RhGMSV (-Gu y –Co) son replicativamente incompatibles. En cambio, la cepa RhGMSV-Co A pudo transreplicar al DNA-B de otro begomovirus, Pepper golden mosaic virus (PepGMV), que posee iterones idénticos. Los pseudorecombinantes fueron viables de acuerdo a los resultados obtenidos por PCR y ensayos de Southern blot. El análisis comparado de las proteínas Rep codificadas por las cepas y variantes de esos virus permitió identificar dos aminoácidos (aa) potencialmente involucrados en el reconocimiento específico de los iterones. Ambos aa residen en una de las hebras de la mini hoja β (β1/β5) que posiblemente interactúa directamente con el DNA en el origen de replicación geminiviral y se localizan cerca del Motivo II conservado en las proteínas iniciadoras de la replicación por círculo rodante (RCR) de una gran variedad de virus. Estos resultados apoyan la hipótesis de que los determinantes de especificidad de Rep se localizan en dos segmentos cortos ampliamente separados entre sí y en la vecindad de los Motivos RCR I y II. Las conclusiones de este estudio adquieren especial relevancia a la luz de la conservación de esos Motivos RCR en las proteínas Rep de todos los miembros del filo Cressdnaviricota, que agrupa a siete familias virales. El segundo estudio fue el análisis funcional de los promotores de dos variantes de Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV-IL) una de Sinaloa (TYLCV-IL[Sin]), que representa al virus nativo de Israel, y una variante (TYLCV-IL[SLP]) que contiene dos mutaciones naturales: 1) una deleción de 29nt en el promotor Rep, y 2) una duplicación de 42 nt en el promotor CP. Se generaron dos construcciones para cada promotor fusionándolos con el gen reportero GUS por cada variante de TYLCV y mediante experimentos de expresión transitoria in planta se logró establecer que el promotor Rep con la deleción de 29 nt tiene menor actividad (~50%) que su contraparte TYLCV-IL[Sin], sugiriendo la existencia de un elemento regulador positivo en el segmento deletado. Al analizar esta región en TYLCV-IL[SLP] se identificó un elemento de 18 nt conservado en la mayoría de los begomovirus del Viejo Mundo (OW), pero inexistente en los BGVs del Nuevo Mundo (NW). En el caso del promotor CP no se apreció un cambio significativo en la actividad relacionada con la duplicación de 42 nt, pues los promotores de ambos aislados de TYLCV expresaron el gen reportero a un nivel similar. En presencia de una fuente de TrAP, la actividad de ambos promotores CP aumentó > 20 veces, en comparación con el promotor en ausencia del transactivador. Por último, se usó la tecnología CRISPR/Cas9 para desarrollar un sistema de interferencia de la replicación de begomovirus. Los sgRNAs se diseñaron seleccionando regiones conservadas en los genomas de estos virus. En total se diseñaron 11 sgRNAs, de los cuales 6 mostraron actividad mediante el ensayo de endonucleasa T7. Mediante esta técnica, se demostró que los sgRNAs son capaces de generar indels en TYLCV, RhGMSV y PepGMV. En experimentos de agroinfiltración en plantas de N benthamiana, mezclando los sgRNAs se logró reducir la carga viral de PepGMV ~9 veces en comparación con el control. Los sgRNAs usados en este trabajo potencialmente pueden interferir con la replicación de una gran variedad de begomovirus."

"Three independent but related studies about begomoviruses are described in this document. In the first study, the replicative compatibility of two strains of Rhynchosia golden mosaic Sinaloa virus (RhGMSV) was analyzed, both presenting different iterons at their replication origins; the strains (-Gu and -Co) were shown to be incompatible in replication. In contrast, the DNA-A of RhGMSV-Co was able to transreplicate the DNA-B of another begomovirus, Pepper golden mosaic virus (PepGMV), which has identical iterons. The pseudo-recombinants were viable according to the results obtained by PCR and Southern blot assays. The comparative analysis of the Rep proteins encoded by the strains and variants of these viruses, allowed the identification of two amino acids (aa) potentially involved in the specific recognition of iterons. Both residues reside in one of the strands of the mini β sheet (β1/β5) that presumably interact directly with the DNA at the geminiviral replication origin, and located near the Motif II which is conserved in the rolling circle replication (RCR) initiator proteins of a wide variety of viruses. These results support the hypothesis that the specificity determinants of Rep are located in two short segments widely separated from each other within the vicinity of the RCR Motifs I and II. The conclusions of this study acquire special relevance in light of the conservation of these RCR Motifs in the Rep proteins of all members of the phylum Cressdnaviricota, which harbor seven viral families. The second study was the functional analysis of the promoters of two variants of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV-IL), one from Sinaloa (TYLCV-IL [Sin]), which represents the WT virus of Israel, and a variant (TYLCV- IL [SLP]) containing two natural mutations: 1) a 29 nt deletion in the Rep promoter, and 2) a 42 nt duplication in the CP promoter. Two constructions were generated for each promoter fused with the GUS reporter gene for each TYLCV variants, and by transient expression experiments in planta it was established that the Rep promoter with the 29 nt deletion has lower activity (~ 50%) than its WT counterpart, TYLCV- IL [Sin], suggesting the existence of a positive regulatory element in the deleted segment. When analyzing this region in TYLCV-IL [SLP], an 18 nt element was identified that was conserved in most of the Old World (OW) begomoviruses, but nonexistent in the New World (NW) BGVs. In the case of the CP promoter no significant change in the activity related to the 42 nt duplication was observed, since the promoters of both TYLCV isolates expressed the reporter gene at a similar level. In the presence of a TrAP source, the activity of both CP promoters increased> 20-fold, compared to the promoter in the absence of the transactivator. Finally, the CRISPR / Cas9 technology was used to develop a replication interference system against begomovirus. The sgRNAs were designed by selecting conserved regions in the genomes of these viruses. In total 11 sgRNAS were designed, 6 of them displayed activity, this was demonstrated through the T7 endonuclease assay. Using this technique, it was shown that sgRNAs are capable of generating indels in TYLCV, RhGMSV and PepGMV. In agroinfiltration experiments in N.benthmiana plants, using a mix of sgRNAs it was possible to reduce the viral load of PepGMV ~ 9 times compared to the control. The sgRNAs presented this work can potentially interfere with the replication of a wide variety of begomoviruses."