Análisis de la evolución in vitro de Candida glabrata bajo condiciones de estrés

Abstract

"C. glabrata es una levadura que se detecta y se aísla con frecuencia de muestras de pacientes inmunocomprometidos, por lo que se le considera un patógeno oportunista de importancia médica. La patogénesis de C. glabrata se atribuye, entre otros factores, a una menor susceptibilidad innata a los antifúngicos en comparación con otras especies comunes de Candida, en especial al fluconazol (FLC), el principal antifúngico utilizado para tratar las infecciones por levaduras del género Candida. Se ha observado que las terapias prolongadas con este fármaco permiten que C. glabrata desarrolle una mayor resistencia a los azoles. Tomando en cuenta lo anterior, utilizamos un modelo de evolución adaptativa y selección in vitro en presencia del antifúngico FLC, para exponer a FLC e inducir la evolución de dos aislados clínicos de C. glabrata y nuestra cepa de referencia en el laboratorio, BG14, que difieren en su suceptibilidad a FLC. Al finalizar 15 pases diarios observamos que las tres cepas evolucionadas crecieron en un gradiente de concentraciones subletales y letales de FLC las cuales fueron de 8 a 256 μg/mL de FLC. Mostramos que la exposición crónica a FLC en los tres aislados resultó en la aparición de mutantes que no lograron crecer en glicerol como única fuente de carbono no fermentable (Gly-), así como en la aparición de células competentes para la respiración (Gly+). La estabilidad de los fenotipos de resistencia y Gly- en ausencia de la presión selectiva, se mantuvo estable en todas las colonias analizadas con excepción de una mutante evolucionada derivada del aislado sensible FLC. El análisis del genoma mitocondrial mostró que, en las mutantes evolucionadas en FLC, el fenotipo Gly- se relaciona con la pérdida del ADN mitocondrial, pero no así en las mutantes evolucionadas Gly+ o en los aislados originales (sin evolucionar). Asimismo, en las mutantes Gly- no fue posible detectar la señal fluorescente de una proteína mitocondrial fusionada con GFP. En conjunto, estos datos indican que la resistencia incrementada a FLC está estrechamente relacionada no solo con la pérdida de funciones mitocondriales, sino también con otros mecanismos que no necesariamente comprometen la función respiratoria."

"C. glabrata is a yeast frequently isolated from samples of immunocompromised patients. For this reason, it is considered a medically relevant opportunistic fungal pathogen. The pathogenesis of C. glabrata is largely attributed to different characteristics called virulence factors, such as low susceptibility to antifungals in comparison with other common Candida species, specifically to fluconazole (FLC), the major drug used for treating infections caused by Candida spp. The long therapies with FLC frequently used in the clinic, allows C. glabrata to develop higher resistance to azoles. Taking this into consideration, we used an experimental strategy based on adaptative evolution in vitro using increasing concentrations of FLC to expose and induce the evolution of two C. glabrata isolates and our standard strain BG14, that differ in the susceptibility profile to FLC. After 15 daily passes, three strains grew under sublethal and lethal FLC concentrations which ranged from 8 to 256 µg/mL FLC. We found that chronic exposure to FLC resulted in the appearance of some mutants unable to grow in glycerol as a sole, non-fermentable carbon resource (Gly- ). We determined the stability of Gly- and FLC resistance phenotypes by growing repeatedly the strains in the absence of selective pressure. We found that the respiratory incompetence phenoytpe was stable for all the colonies derived from strains BG14 and A. However, in one case, a derivative from strain B reverted to respiratory competence (Gly+). Mitochondrial DNA analysis showed that in the Gly- FLC evolved strains, the inability to grow on glycerol as carbon source, is related to the loss of mitochondrial DNA. Instead, the Gly+ FLC evolved strains as well as the parental strains (not evolved), all contained mitochondrial DNA. In addition, we could not detect a mitochondrial protein fused with GFP in Gly- strains, but it was easily observed in the Gly+ evolved strains. The results indicate that increased resistance to FLC is closely related to loss of respiratory functions, and to other mechanisms that do not necessarily compromise the mitochondrial function"