Generación de vectores para la caracterización de los uORFs presentes en las poliamino oxidasas de Arabidopsis thaliana

Abstract

"Las poliaminas (PA) son policationes derivados de aminoácidos, esenciales para el desarrollo y crecimiento en los organismos vivos. Bajo condiciones de estrés, las células vegetales modulan los niveles de PA mediante la regulación de las enzimas encargadas de su biosíntesis y catabolismo, entre estas las poliamina oxidasas (PAOs). Las PAOs catalizan la desaminación oxidativa de las PA superiores espermidina y espermina. Nuestro grupo de investigación ha comenzado a caracterizar el marco de lectura abierto rio arriba (uORF), presente en el 5’UTR de AtPAO2, el cual ejerce un efecto represor sobre la traducción del ORF principal (mORF). El extremo N-terminal del péptido uORF-PAO2 muestra un alto grado de conservación, lo que sugiere que estos aminoácidos pudieran estar implicados en la función regulatoria. En esta tesis generamos diferentes vectores de expresión que incluyen mutaciones puntuales en aminoácidos conservados del péptido uORF-PAO2 (Ser-14, Leu-21-22, Leu-48) para analizar sí estos son clave en la represión traduccional. Además, con el objetivo de comenzar a elucidar la función de los uORFs de AtPAO3 y AtPAO4 se generaron vectores de entrada y/o destino con las versiones WT o mutantes de dichos uORFs. Para ello, la región WT y las versiones mutantes del 5’UTR de cada AtPAO se amplificó por PCR, se clonó en el vector de entrada pCR8/GW/TOPO, y algunas de ellas fueron recombinadas en el vector destino pMDC141. En las versiones mutantes, el codón de inicio de la traducción (ATG) del uORF fue sustituido por GCT, con el objetivo de determinar si la traducción del uORF es necesaria para que ejerza su efecto regulatorio. Las construcciones generadas en este trabajo de investigación se utilizarán para generar líneas reporteras de Arabidopsis thaliana en donde se determinará el efecto de los uORFs presentes en los ARNs mensajeros de las AtPAOs de acuerdo con los cambios en la expresión del gen reportero GUS."

"Polyamines (PA) are polycationic compounds derived from amino acids, essential for growth and development in living organisms. Under stress conditions, plant cells modulate PA levels by regulating the enzymes involved in their biosynthesis and catabolism, including polyamine oxidases (PAOs). PAOs catalyze the oxidative deamination of higher PA such as spermidine and spermine. Our research group has started to characterize the upstream open reading frame (uORF) present in the 5’UTR of AtPAO2, which exerts a repressive effect on the translation of the main ORF (mORF). The N-terminal end of the uORF-PAO2 peptide shows a high degree of conservation, suggesting that these amino acids may be involved in the regulatory function. In this thesis, we generated different expression vectors that include point mutations in conserved amino acids of the uORF-PAO2 peptide (Ser-14, Leu-21-22, Leu-48) to analyze if they are key in translational repression. Additionally, to begin elucidating the function of uORFs in AtPAO3 and AtPAO4, entry and/or destination vectors were generated with wild-type (WT) or mutant versions of these uORFs. For this purpose, the WT and mutant versions of the 5' UTR of each AtPAO were amplified by PCR, cloned into the pCR8/GW/TOPO entry vector, and some of them were recombined into the pMDC141 destination vector. In the mutant versions, the translation initiation codon (ATG) of the uORF was replaced by GCT, to determine if the translation of the uORF is necessary for it to exert its regulatory effect. The constructions generated in this research will be used to generate reporter lines of Arabidopsis thaliana, where the effect of uORFs present in the messenger RNAs of AtPAOs will be determined according to changes in the expression of the reporter gene GUS."