La proteína G0S2, análisis de interacción y ensayos de cristalización del complejo G0S2/Bcl-2

Abstract

"G0S2 es una proteína que participa en múltiples procesos celulares en vertebrados. Su función más conocida es la inhibición de la enzima triglicérido lipasa de tejido adiposo, lo que resulta en la regulación negativa de la lipolisis. En este trabajo nos enfocamos en la participación de G0S2 en la apoptosis, donde al interactuar con Bcl-2 se libera la proteína Bax interrupiendo la formación del heterodímero Bcl-2/Bax. La liberación de Bax da inicio al proceso de apoptosis inhibiendo la proliferación celular. El objetivo de este trabajo es caracterizar la interacción molecular de las proteínas hG0S2 y hBcl-2 durante la formación del complejo hG0S2/hBcl-2 mediante técnicas bioquímicas, biofísicas y con dos mutantes sitio dirigidas. Para esto se realizó la clonación y expresión de las construcciones SUMO-hG0S2, hBcl-2 y la doble mutante SUMO-hG0S2_R57A-D58A en el vector pET28pps con las enzimas de restricción NdeI y HindIII. Posteriormente se continuó con la purificación de las construcciones mediante cromatografía de afinidad a níquel (Ni-NTA) y una segunda purificación por cromatografía por exclusión molecular (SEC), después se evaluó la interacción y formación del complejo hG0S2/hBcl-2 mediante SEC y dispersión dinámica de luz (DLS). Además, se realizaron experimentos de cristalización del complejo hG0S2/hBcl-2 mediante la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Pudimos realizar exitosamente la clonación, expresión y purificación de cada una de las construcciones obteniendo 0.736 mg/ml de hG0S2, 2.4 mg/ml de Bcl-2 y 0.508 mg/ml de la doble mutante SUMO-hG0S2_R57A-D58A. La identidad de las proteínas fue confirmada por geles de poliacrilamida SDS-PAGE al 17%. La evaluación de la interacción del complejo hG0S2/hBcl-2 mediante cromatografía de exclusión molecular fue exitosa obteniendo un complejo con un peso de 48.9kDa, el cuál fue confirmado con los experimentos de DLS donde observamos un peso de 34.4 kDa. Con esta muestra se procedió a realizar pruebas de cristalización del complejo, pero aún no se han obtenido cristales. Con estos resultados concluimos que existe una interacción fuerte y estable entre las proteínas hG0S2 y hBcl-2 ya que el complejo eluye en un solo pico. Se debe mejorar la concentración del complejo y probar diferentes condiciones de cristalización."

"G0S2 is a protein involved in multiple cellular processes in vertebrates. The best known function is the inhibition of the enzyme triglyceride lipase of adipose tissue, which results in the negative regulation of lipolysis. In this work we focus on the involvement of G0S2 in apoptosis, where by interaction with Bcl-2 it facilitates the release of the Bax protein by disrupting the formation of the Bcl-2/Bax heterodimer. The release of Bax initiates the apoptosis process by inhibiting cell proliferation. The aim of this work is to characterize the molecular interaction of hG0S2 and hBcl-2 proteins during the formation of the hG0S2/hBcl-2 complex using biochemical and biophysical techniques, as well as two site-directed mutations constructed in the C-terminal region of G0S2. For this purpose, SUMO-hG0S2, hBcl-2 and the double mutant SUMO-hG0S2_R57A-D58A were cloned and expressed in the pET28pps vector with the restriction enzymes NdeI and HindIII. Subsequently, the purification of the constructs was continued by nickel affinity chromatography (Ni-NTA) followed by molecular exclusion chromatography (SEC), then the formation and evaluation of the hG0S2/hBcl-2 complex interaction was performed by SEC and dynamic light scattering (DLS). In addition, crystallization experiments of the hG0S2/hBcl-2 complex were performed using the vapor sitting drop technique. We were able to successfully perform cloning, expression, and purification of each of the constructs obtaining 0.736 mg/ml of hG0S2, 2.4 mg/ml of Bcl-2 and 0.508 mg/ml of the double mutant SUMO-hG0S2_R57A-D58A. Polyacrylamide gels show that the fractions obtained from the chromatograms correspond to each protein. The evaluation of the interaction of the hG0S2/hBcl-2 complex by molecular exclusion chromatography was successful obtaining a complex with a weight of 48.9 kDa, which was confirmed by DLS experiments where we observed a weight of 34.4 kDa. With this sample we proceeded to perform crystallization tests of the complex, but crystals have not yet been obtained. Finally, with these results we can conclude that there is a strong and stable interaction between hG0S2 and hBcl-2 proteins since in the molecular exclusion chromatogram the complex elutes in a single peak. The concentration of the complex should be improved, and different crystallization conditions should be tested."